灌注型生物活化骨修復節(jié)段性骨缺損的實驗研究.pdf

1、創(chuàng)傷及腫瘤所致的節(jié)段性骨缺損一直是骨科醫(yī)生面臨的難題之一。目前治療節(jié)段性骨缺損的方法多種多樣，既有自體骨移植、異體骨移植、人工關節(jié)置換等傳統(tǒng)技術，又有尚未在臨床上廣泛應用的新型生物材料修復技術，然而各種移植方法、技術都存在目前尚未能很好解決的缺點，致使臨床治療中，骨科醫(yī)生就治療方法、技術難以達成共識，影響患者治療及骨科醫(yī)生之間的交流。近年來隨著材料科學的發(fā)展及骨組織工程技術的進步，人工骨的研究越來越受到骨科工作者及材料專家的青睞。研發(fā)具

2、有優(yōu)良性能的新型支架材料和探尋組織工程骨培養(yǎng)的新方法是目前組織工程骨研究領域的兩大熱點。本實驗選取新工藝生產(chǎn)的可控性微結構多孔磷酸三鈣生物陶瓷（β-TCP）為支架材料，以自體骨髓基質(zhì)干細胞（BMSC)為種子細胞，探尋一種觀察不透光支架材料上活細胞增殖的方法，并利用灌注培養(yǎng)法體外構建生物活性組織工程骨、植入山羊節(jié)段性脛骨缺損處，研究體外活化組織工程骨的可行性及其修復節(jié)段性骨缺損的能力。 一、DiI 熒光標記的骨髓基質(zhì)干細胞與支架材

3、料復合后觀察的研究 目的 通過DiI 熒光標記后的骨髓基質(zhì)干細胞（BMSC）與β-磷酸三鈣（β-TCP）支架復合后的鏡下觀察，找到一種大塊支架材料上活細胞觀察的新方法。為組織工程骨的研究提供新的可行性方法。 方法 取山羊的第3 代BMSC消化后分為實驗組和對照組，實驗組DiI 標記，另一組為不標記的正常細胞，測定生長曲線。另以相同數(shù)量兩組細胞同β-TCP 材料復合后培養(yǎng)，測定兩組細胞貼附率，在第3、7、1

4、4 天時，測其在β-TCP 材料上的增殖情況，并在熒光顯微鏡下連續(xù)觀察標記后的BMSC 的生長狀況。 結果 實驗組和對照組的生長曲線基本吻合，兩組之間各時間點的細胞計數(shù)都沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。兩組細胞與β-TCP 材料復合三維共培養(yǎng)后，第3、7、14 天細胞增值率未見顯著性差異（P>0.05）。熒光顯微鏡觀察染色后的BMSC 細胞可見細胞胞膜發(fā)出紅色熒光呈環(huán)狀，胞核未著色，顯現(xiàn)良好。 結論 Di

5、I 熒光標記后的BMSC 生長增殖，可在熒光顯微鏡下活體連續(xù)觀察，在大段不透明支架材料上的細胞觀察能作為一種較好的新方法來研究種子細胞與支架材料的相互作用，可以成為組織工程骨研究中的新觀察方法推廣應用。 二、組織工程活化骨體外動態(tài)灌注培養(yǎng)的研究 目的 研究灌注培養(yǎng)法體外構建長節(jié)段組織工程活化骨的可行性。 方法 利用灌注型生物反應器對復合骨髓基質(zhì)干細胞的大段磷酸三鈣柱狀載體進行動態(tài)灌注培養(yǎng)(動態(tài)培養(yǎng)

6、組) 2 周或傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)(靜態(tài)培養(yǎng)組)2周,通過葡萄糖日耗量、細胞活力(MTT 比色法)檢測以及硬組織切片觀察等方法，檢測BMSC 在載體內(nèi)的擴增情況。 結果 葡萄糖的日消耗量隨培養(yǎng)時間的延長而增加，培養(yǎng)前10 天較后4 天增加更迅速，動態(tài)培養(yǎng)組的葡萄糖日耗量明顯大于靜態(tài)培養(yǎng)組。動態(tài)培養(yǎng)組的細胞活力明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)組。在動態(tài)灌注培養(yǎng)下，骨髓基質(zhì)干細胞能夠在大段載體中心及周緣存活并增殖，而在靜態(tài)培養(yǎng)下，骨髓基質(zhì)干細胞僅能

7、在載體周緣存活增殖，細胞數(shù)量明顯少于動態(tài)培養(yǎng)組。 結論 灌注型生物反應器使骨髓基質(zhì)干細胞在大段三維載體內(nèi)存活并增殖，且分布均勻，提高了細胞在載體內(nèi)的復合效率，是一種可行的組織工程骨體外活化方法。 三、組織工程活化骨修復山羊節(jié)段性骨缺損的實驗研究 目的 探討以多孔β-磷酸三鈣生物陶瓷(β-tricalcium phosphate ,β-TCP)與自體骨髓間充質(zhì)干細胞(autologous bone

8、marrow mesenchymal stemcells ,BMSC) 體外動態(tài)灌注培養(yǎng)的生物活化組織工程骨修復節(jié)段性骨缺損的效果。 方法 體外培養(yǎng)山羊BMSC，利用自制生物反應器將自體BMSC 與多孔β-TCP 體外培養(yǎng)，分為動態(tài)灌注培養(yǎng)、靜態(tài)培養(yǎng)兩組，兩組均體外培養(yǎng)兩周后，植入山羊左、右脛骨中段人工造模的30 mm 長的骨缺損處，實驗組植入動態(tài)灌注培養(yǎng)組織工程骨；對照組植入靜態(tài)培養(yǎng)組織工程骨。術后及飼養(yǎng)期間缺損區(qū)定期

9、行放射學分析，術后24 周處死動物行組織學、Micro-CT 等成骨性檢測。 結果 X 線分析顯示實驗組成骨優(yōu)于對照組，硬組織切片VanGieson 染色分析可見實驗組明顯多于對照組，Micro－CT 分析可見實驗組BMD、TMD 均較對照組不同，明顯為骨轉(zhuǎn)換后的結果（均可見p<0.05）。 結論 利用自制組織工程骨體外生物活化器將β-TCP 與自體BMSC 體外動態(tài)灌注培養(yǎng)的組織工程骨在成骨性能、成骨量