甜菜堿對肥育豬脂肪代謝及其關鍵酶基因表達的影響與機理研究.pdf

1、本課題以肥育豬為試驗對象，通過飼養(yǎng)試驗、屠宰試驗、肝細胞體外培養(yǎng)，從生理生化、脂肪代謝相關的酶活性和部分關鍵酶(脂肪酸合成酶、線粒體肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ)基因表達變化、生長激素脈沖分泌模式及其它相關激素水平等方面探討了甜菜堿對肥育豬脂肪代謝的影響，旨在闡明甜菜堿改善肥育豬胴體組成的機理，為甜菜堿作為新型的營養(yǎng)再分配劑在養(yǎng)豬業(yè)上的應用提供科學依據(jù)。 根據(jù)Genebank登錄的豬脂肪酸合成酶(FAS)、肝型肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I(L-CPT

2、Ⅰ)、肌肉型肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(M-CPT Ⅰ)和內(nèi)標β-acfin基因序列設計引物，分別以皮下脂肪組織、肝臟和背最長肌rnRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR反應，克隆得到了相應的FAS、L-CPT Ⅰ、M-CPT Ⅰ及內(nèi)標β-actin的基因片斷。對測序結(jié)果進行序列分析表明，得到的FAS、L-CPT Ⅰ、M-CPT Ⅰ及內(nèi)標β-actin基因序列與Genebank登錄的相應基因片斷(登錄號分別為AY183428、AF288789、AY181

3、062和U07786)同源性分別為98.77％、99.59％、99.61％和99.27％。在此基礎上，進一步探討了PCR反應中適宜的退火溫度、Mg<'2+>濃度和循環(huán)次數(shù)，構(gòu)建了適合相應基因序列的優(yōu)化半定量RT-PCR法，以用于研究甜菜堿對肥育豬皮下脂肪組織FAS基因、肝臟和肌肉CPT Ⅰ基因mRNA表達量的影響。 48頭體重55kg 左右的“杜洛克×斯格(15系×12/36系)”雜交肥育豬，按試驗要求分成2組，每組設3個重復，

4、每個重復8頭，公母各半，分別飼喂添加O或1250mg/kg鹽酸甜菜堿(以純品計)的玉米．豆粕型飼糧。試驗預試期7 d，正驗期42 d。飼養(yǎng)期間，試驗豬自由采食、飲水。飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，從試驗組和對照組的每個重復中各選取體重90kg左右的試驗豬2頭(公母各半)，共12頭，飼喂相應飼料，1 h后，分別耳靜脈采血，試驗于13∶00至16∶00，每隔15 min采樣一次，并分別制各血清，以研究甜菜堿對肥育豬生長激素(GH)脈沖分泌的影響。按常規(guī)方

5、法進行屠宰，測定胴體組成，并采集血清、肝臟、肌肉和皮下脂肪樣品，進行相關指標分析。 肝細胞體外培養(yǎng)試驗設終濃度為1 mmol/L，肉堿、2 mmol/L，甜菜堿、4 mmol/L甜菜堿、1 mmol/L肉堿+2 mmol/L甜菜堿、1 mmol/L肉堿+4 mmol/L甜菜堿及空白對照6個處理，每個處理設3個重復，分別測定培養(yǎng)48、96h時肝細胞線粒體CPT Ⅰ活性。 飼養(yǎng)試驗結(jié)果表明：添加甜菜堿(1250 mg/Kg)

6、使肥育豬日增重提高了5.5％(P<0.05)，采食量無顯著影響(P>0.05)，料重比呈降低趨勢(P>0.05)。 屠宰試驗結(jié)果顯示：添加甜菜堿(1250 mg/kg)明顯改善了肥育豬的胴體組成，胴體瘦肉率提高了5.2％(P<0.01)，眼肌面積增大了17.6％(P<0.01)，胴體脂肪率和平均背膘厚分別降低了13.1％(P<0.01)和10.3％(P<0.05)。甜菜堿對肥育豬屠宰率、皮膚比率、骨骼比率、板油重無顯著影響(P>

7、0.05)。 肝臟和背最長肌樣品分析表明：①添加甜菜堿(1250 mg/kg)，肥育豬背最長肌粗脂肪含量提高了23.6％(P<0.05)，肝臟粗脂肪含量呈下降趨勢(P>0.05)。甜菜堿對肥育豬肝臟和背最長肌粗蛋白含量無顯著影響(P>0.05)。②甜菜堿使肥育豬肝臟游離肉堿含量、背最長肌酸不溶肉堿含量分別提高了19.5％(P<0.05)和45.6％(P<0.01)。而且，甜菜堿顯著降低了肥育豬背最長肌線粒體CPT Ⅰ活性及其mR

8、NA表達，兩者分別降低了11.1％(P<0.05)和14.6％(P<0.05)。但甜菜堿對肝臟線粒體CPT Ⅰ活性及其mRNA表達未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。另外，肥育豬肝臟和背最長肌線粒體CPT Ⅰ活性與CPT Ⅰ mRNA表達量之間具有較好的相關性(相關系數(shù)分別為0.67和0.72，P<0.05)。 脂肪樣品分析顯示：添加甜菜堿(1250 mg/kg)使肥育豬皮下脂肪組織脂肪生成酶、激素敏感脂酶、脂蛋白脂酶活性發(fā)生了顯著

9、變化。與對照組相比，試驗組皮下脂肪組織激素敏感脂酶活性提高了15.1％(P<0.05)，F(xiàn)AS、乙酰-CoA羧化酶、蘋果酸脫氫酶及脂蛋白脂酶的活性分別降低了18.8％(P<0.05)、18.0％(P4.01)、14．5％(P<0.05)和8.9％(P<0.05)，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶的活性呈下降趨勢(P>0.05)。而且，甜菜堿使肥育豬皮下脂肪FAS mRNA表達降低了25.0％(P<0.05)，F(xiàn)AS活性和FAS m

10、RNA表達量之間具有較好的相關性(相關系數(shù)為0.93，P<0.01)。另外，甜菜堿使肥育豬皮下脂肪cAMP含量提高了23.4％(P<0.05)。 生長激素脈沖分泌特點分析表明：添加甜菜堿(1250 mg/kg)顯著提高肥育豬GH分泌的基礎水平、總體水平和峰強度，分別比對照組提高了41.8％(P<0.01)、49.0％(P<0.01)和35.1％(P<0.05)。甜菜堿對肥育豬GH分泌頻率和峰持續(xù)時間未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)

11、。 血清指標分析顯示，添加甜菜堿(1250 mg/kg)明顯提高了肥育豬血清胰島素樣生長因子-Ⅰ、胰島素、游離三碘甲腺原氨酸、游離四碘甲腺原氨酸和促甲狀腺激素的水平，分別比對照組提高了55.5％(P<0.01)、42.3％(P<0.05)、58.0％(P<0.01)、51.8％ (P<0.01)和49.7％(P<0.01)。甜菜堿使肥育豬血清總蛋白、游離脂肪酸含量和脂肪酶活性分別提高了8.8％(P<0.05)、25.7％

12、(P<0.01)和22.6％(P<0.01)，血清尿素氮含量降低了21.6％(P<0.01)，但對血清其它生化指標無顯著影響(P>0.05)。細胞培養(yǎng)試驗結(jié)果顯示：2 mmol/L、4 mmol/L甜菜堿對培養(yǎng)48 h、96 h的豬原代肝細胞線粒體CPT Ⅰ活性無顯著影響(P>0.05)，1 mmol/L肉堿、肉堿+甜菜堿顯著提高了CPT Ⅰ活性(P<0.01)；與1 mmol/L肉堿處理組相比，肉堿+甜菜堿對CPT Ⅰ活性的影響不明顯

13、(P>0.05)；經(jīng)甜菜堿、肉堿處理的CPTⅠ活性在96 h時比48 h時高(P<0.05)。 本研究結(jié)果提示：甜菜堿可顯著提高肥育豬胴體瘦肉率和眼肌面積，降低胴體脂肪率和背膘厚，并可促進肥育豬的生長；甜菜堿可顯著提高豬血清GH水平，影響GH脈沖分泌幅度；甜菜堿似通過影響豬體內(nèi)GH、胰島素樣生長因子-Ⅰ、游離三碘甲腺原氨酸、游離四碘甲腺原氨酸、促甲狀腺激素及胰島素水平，降低皮下脂肪組織脂肪生成酶的活性和基因表達(如FAS mRN