sflk1-IFN-γ融合蛋白的分離與純化.pdf

1、惡性腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移必須依靠腫瘤新生血管提供足夠的營(yíng)養(yǎng),因此抑制或破壞腫瘤血管生成已成為近年來腫瘤治療的新方法.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)與表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體VEGFR2結(jié)合所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是血管生成中的限速步驟,在整個(gè)血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(sVEGFR2,在小鼠中被稱為silkl)可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合 VEGF,從而阻斷VEGF與VEGFR2結(jié)合所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生

2、成和腫瘤的生長(zhǎng).IFN-γ是細(xì)胞免疫應(yīng)答中非常重要的效應(yīng)因子,能誘導(dǎo)CTL,應(yīng)答及Th1細(xì)胞的分化,并且尚能直接抑制多種腫瘤的生長(zhǎng),同時(shí)它自身也有抑制腫瘤血管生成的作用.本所已經(jīng)構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/silkl.IFN-γ重組質(zhì)粒,獲得高效穩(wěn)定表達(dá)的CHO細(xì)胞,并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物silkl-IFN-γ融合蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行了初步研究. 目的： 為了進(jìn)一步研究silkl-IFN-γ融合蛋白的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物學(xué)活性

3、以及進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)等,本實(shí)驗(yàn)對(duì)CHO細(xì)胞上清液中silkl-IFN-γ融合蛋白進(jìn)行分離與純化,擬獲得純度較高的融合蛋白,并探討真核細(xì)胞表達(dá)所蛋白的分離純化方法. 方法：大規(guī)模培養(yǎng)高效穩(wěn)定表達(dá)sflkl-IFN-γ融合蛋白的CHO細(xì)胞,收集上清,經(jīng)超濾、鹽析或陰離子交換層析(IEX)方法進(jìn)行初步的濃縮與分離,再經(jīng)疏水層析(HIC)進(jìn)行中度純化及凝膠過濾(GF)精細(xì)純化并采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白純度的鑒定. 結(jié)果：

4、 1.利用低血清(5﹪FCS)培養(yǎng)表達(dá)silkl-IFN-γ融合蛋白的CHO細(xì)胞,收集的上清中總蛋白的濃度為1741±40μg/ml,sflk1的濃度為55.2±6.70ng/ml,純度為2.72～3.64x10<'-3>﹪,IFN-γ的濃度為1.4±0.78 ng/ml,純度為0.03～0.14x10<-3>﹪; 2.通過鹽析可將細(xì)胞上清液中的sflk1-IFN-γ融合蛋白中IFN-γ純度提高13.25倍,回收率16﹪;利

5、用超濾膜Biomax-30濃縮細(xì)胞上清液,可將細(xì)胞上清液中的sflk1-IFN-γ融合蛋白中IFN-γ純度提高3.38倍,回收率35.1﹪;采用陰離子交換層析可將細(xì)胞上清液中的silk1-IFN-γ融合蛋白中IFN-γ純度提高4.18倍,回收率48﹪. 3.經(jīng)疏水層析中度純化,可將細(xì)胞上清液中的sflk1-IFN-γ融合蛋白中sflk1純度由4.37x10<'-3>﹪提高到48x10<'-3>﹪,回收率19.2﹪4.經(jīng)凝膠過濾精