金屬硫蛋白拮抗細(xì)菌脂多糖急性肝損傷的機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)菌脂多糖(LPS)是一類由革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素。在感染等情況下，大量LPS進(jìn)入機(jī)體可引發(fā)全身多器官炎癥反應(yīng)。低劑量的LPS同樣也可以導(dǎo)致機(jī)體的損傷。由于肝臟是清除內(nèi)毒素的主要場(chǎng)所，肝臟成為內(nèi)毒素引起的全身炎癥反應(yīng)中最易受損的器官之一。因此，研究LPS引起的炎癥反應(yīng)與肝臟損傷的關(guān)系具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。 金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)富含半胱氨酸、低分子量的、可被金屬誘導(dǎo)產(chǎn)生的金屬結(jié)合蛋白。MT在重金屬解毒，

2、維護(hù)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)能力等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，是一種可以抵抗外源性損傷的細(xì)胞防御性蛋白。Tomoki等發(fā)現(xiàn)MT基因敲除小鼠對(duì)LPS引起的炎癥反應(yīng)較與之對(duì)應(yīng)的野生型小鼠更為敏感，提示MT在LPS引起的炎癥損傷中發(fā)揮一定的保護(hù)作用，但其具體機(jī)制目前尚不清楚。 本研究通過觀察MT(MT-Ⅰ、MT-Ⅱ)基因敲除(MT-/-)小鼠、與相對(duì)應(yīng)的野生型(MT+/+)小鼠以及以硫酸鋅(ZnSO4)誘導(dǎo)形成的MT高表達(dá)小鼠三種動(dòng)物

3、模型對(duì)LPS引起的急性肝臟損傷程度的比較。進(jìn)而以肝臟KC細(xì)胞特異性抑制劑氯化釓(GdCl<,3>)抑制KC活性，應(yīng)用NF-кB特異性抑制劑四氫化吡咯二硫代氨基甲酸脂(PDTC)抑制NF-кB的轉(zhuǎn)錄活性，探討KC細(xì)胞、NF-кB信號(hào)通路在LPS致肝臟急性炎癥過程中的作用及MT的調(diào)控作用。初步探討金屬硫蛋白在LPS引發(fā)急性肝臟損傷中的作用及其可能機(jī)制。本課題包括以下兩個(gè)部分： 第一部分：MT對(duì)LPS致急性肝臟炎性損傷的影響

4、使用MT基因敲除(MT-/-)小鼠、野生型(MT+/+)小鼠為動(dòng)物模型，采用鎘飽和法測(cè)定MT含量，確證動(dòng)物模型可靠性。腹腔注射不同劑量LPS(1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)24小時(shí)后處死動(dòng)物，以10mg/kg劑量腹腔注射LPS分別在3h、6h、12h、24h、48h后處死動(dòng)物，每組6只動(dòng)物。通過組織病理學(xué)、血液生化分析比較觀察不同MT表達(dá)水平動(dòng)物模型對(duì)LPS致急性肝臟炎癥損傷的敏感性差異。采用ELISA法測(cè)

5、定細(xì)胞因子含量，GRIESS法檢測(cè)NO含量，觀察不同MT表達(dá)水平動(dòng)物模型中上述具有細(xì)胞毒性效應(yīng)炎性介質(zhì)表達(dá)的差異。通過脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、蛋白質(zhì)過氧化產(chǎn)物的測(cè)定，從自由基損傷角度初步觀察MT對(duì)LPS致肝臟炎癥損傷保護(hù)效應(yīng)的可能機(jī)制。 結(jié)果表明，LPS可以使兩種小鼠ALT、AST等血清酶活性均呈時(shí)間、劑量依賴性升高。組織病理學(xué)檢查顯示，肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞濁腫，空泡變性、灶性液化壞死、星狀細(xì)胞增生。細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表

6、達(dá)上調(diào)，血清以及肝臟組織內(nèi)NO含量增加。肝臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加。MT+/+小鼠血清ALT，AST等升高趨勢(shì)較MT-/-小鼠更為顯著。炎癥反應(yīng)早期MT-/-小鼠肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度輕于MT+/+小鼠，隨炎癥反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，MT-/-小鼠較MT+/+小鼠肝組織損傷程度呈加重趨勢(shì)。LPS作用下，MT-/-小鼠較MT+/+小鼠細(xì)胞因子、NO等細(xì)胞毒性炎性介質(zhì)表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)更為顯著。LPS致MT-/-小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化程度較MT+/+小鼠更為嚴(yán)

7、重。結(jié)論MT對(duì)LPS引起的肝臟損傷具有保護(hù)作用，其可能機(jī)制與MT對(duì)L2S以及對(duì)LPS致炎過程中生成的ROS的清除作用以及MT表達(dá)水平導(dǎo)致機(jī)體對(duì)外源性LPS刺激清除作用不同有關(guān)。 以Zn(ZnSO<,4> 300μmol/kg s.c.連續(xù)給藥兩天)作為誘導(dǎo)劑形成MT的高表達(dá)小鼠為動(dòng)物模型，通過鎘飽和法測(cè)定肝組織內(nèi)MT含量，通過血液生化活性分析。肝臟組織病理學(xué)檢查、細(xì)胞因子、NO測(cè)定、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物檢測(cè)，比較觀察MT表達(dá)增高是否有

8、利于機(jī)體抵抗LPS致急性肝臟炎性損傷。結(jié)果表明，Zn可以顯著增加野生型小鼠肝組織內(nèi)MT含量，對(duì)敲除型小鼠肝組織內(nèi)MT含量無影響。Zn預(yù)處理可以顯著降低野生型小鼠血清酶升高趨勢(shì)，可以有效減輕野生型小鼠肝組織病理損傷程度，減少細(xì)胞因子、NO等細(xì)胞毒性炎性介質(zhì)的生成，減輕肝組織脂質(zhì)過氧化損傷程度。Zn預(yù)處理對(duì)MT敲除型小鼠弱于野生型小鼠。上述結(jié)果進(jìn)一步說明MT對(duì)LPS致肝臟損傷具有一定的保護(hù)效應(yīng)，其可能作用機(jī)制與其影響細(xì)胞毒性炎性介質(zhì)的生成以

9、及直接清除致炎過程中生成的大量活性氧自由基有關(guān)。 第二部分：Kupffer細(xì)胞及NF-кB在MT對(duì)LPS致肝臟炎癥損傷保護(hù)效應(yīng)中的作用 采用KC特異性抑制劑氯化釓GdCl<,3>，觀察其對(duì)LPS引起的兩種小鼠急性肝臟損傷的影響。將MT基因敲除小鼠(MT-/-)及與之對(duì)應(yīng)的野生型小鼠(MT+/+)各分為4組：生理鹽水對(duì)照組、LPS染毒組、GdCl<,3>組、GdCl<,3>預(yù)處理+LPS染毒組。動(dòng)物腹腔注射LPS(10mg

10、/kg)或生理鹽水(NS)，此前24h給予GdCl<,3>(10mg/kg，i.v.)或NS預(yù)處理。注射LPS后24h測(cè)定鎘飽和法測(cè)定肝臟金屬硫蛋白(MT)含量，血清酶活力，進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查，檢測(cè)-氧化氮(NO)，細(xì)胞因子含量，檢測(cè)肝組織脂質(zhì)過氧化程度，判定不同處理對(duì)MT-/-小鼠及MT+/+小鼠肝臟的影響的差異。結(jié)果表明，氯化釓、LPS均可以誘導(dǎo)MT+/+小鼠肝臟MT生成。GdCl<,3>預(yù)處理可以降低LPS對(duì)MT-/-小鼠及MT

11、+/+小鼠血清中ALT，AST等酶活力，血清以及組織內(nèi)NO、細(xì)胞因子含量的影響，可以減輕LPS對(duì)兩種小鼠肝組織病理學(xué)損傷，有效減輕LPS對(duì)MT-/-小鼠及MT+/+小鼠引起的肝臟損傷，其可能機(jī)制與其對(duì)肝臟Kupffer細(xì)胞抑制作用有關(guān)。同時(shí)GdCl3預(yù)處理消除了LPS致兩種基因型小鼠肝臟炎癥反應(yīng)之間的差異，提示MT發(fā)揮這種保護(hù)作用的可能途徑是LPS與肝臟KC相互作用后的某個(gè)環(huán)節(jié)。采用NF-кB特異性抑制劑PDTC，觀察NF-кB在MT保

12、護(hù)LPS急性肝臟損傷中保護(hù)效應(yīng)的作用，在注射LPS前30min，腹腔注射PDTC40mg/kg，LPS劑量為10mg/kg i.p.，作用24h后處死動(dòng)物，結(jié)果觀察到PDTC可以有效降低兩種小鼠血清酶活性，減少血液中TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子，血清以及肝臟組織中NO含量，降低肝組織TNF-α表達(dá)量，同時(shí)減輕兩種小鼠肝臟組織病理學(xué)損傷程度，減輕肝組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成量。既以PDTC預(yù)處理消除MT自由基清除作用對(duì)NF-к