RNAi介導(dǎo)的Lcy基因沉默對(duì)番茄果實(shí)中番茄紅素含量的影響.pdf

1、番茄紅素(Lycopene)是植物中的一種天然色素，屬于類胡蘿卜素中的一種，它是許多類胡蘿卜素生物合成的中間體，經(jīng)過(guò)環(huán)化可形成其它類胡蘿卜素。番茄紅素主要存在于番茄、西瓜、紅色葡萄柚等植物的果實(shí)，茶的葉片以及蘿卜、胡蘿卜等植物的根部，其中以番茄果實(shí)中的番茄紅素含量最高，其含量可達(dá)到3～14mg/100g。在成熟的番茄果實(shí)中，番茄紅素懸浮遍布于果肉中。番茄紅素是類胡蘿卜素中活性最強(qiáng)的抗氧化劑，有延遲衰老的作用，可以預(yù)防和緩解多種疾病，且對(duì)

2、人體沒(méi)有任何毒副作用，故被認(rèn)定為營(yíng)養(yǎng)型保健食品。番茄紅素在西方飲食中非常盛行，已被許多國(guó)家批準(zhǔn)使用于食品、化裝品和藥品。因此，培育高番茄紅素的番茄品種，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外番茄品質(zhì)育種的熱點(diǎn)。番茄紅素在植物細(xì)胞中的合成是在質(zhì)體和葉綠體中進(jìn)行的，其生物合成的過(guò)程為：八氫番茄紅素(Psy)在脫氫酶作用下依次脫氫生成六氫番茄紅素、鏈孢紅素和番茄紅素。番茄紅素在番茄紅素環(huán)化酶(Lcy)的作用下轉(zhuǎn)化為其它類胡蘿卜素。如果通過(guò)RNAi抑制番茄果實(shí)中番茄紅

3、素B環(huán)化酶基因的表達(dá)，就可以阻止番茄紅素降解，促進(jìn)其積累，從而創(chuàng)造高番茄紅素的轉(zhuǎn)基因番茄新種質(zhì)。 本實(shí)驗(yàn)從番茄基因組中分離了Pds啟動(dòng)子片段，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將Pds-GUS基因?qū)敕阎校芯縋ds啟動(dòng)子的表達(dá)特性；同時(shí)根據(jù)RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)的RNA沉默(RdRP)原理，將番茄紅素β環(huán)化酶基因(Lcy-β)片段通過(guò)一段內(nèi)含子構(gòu)建成dsRNA基因，并用具有果實(shí)特異性表達(dá)的Pds啟動(dòng)子調(diào)控該RNAi基因的表達(dá)，導(dǎo)入番茄后研究抑

4、制Lcy基因表達(dá)對(duì)番茄果實(shí)中番茄紅素含量的影響。該研究結(jié)果可為借助分子改良途徑提高番茄果實(shí)的番茄紅素含量奠定基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果包括以下幾個(gè)方面： 1．番茄Pds啟動(dòng)子的克隆與功能分析根據(jù)GenBank中公布的番茄Pds啟動(dòng)子序列(U46919)設(shè)計(jì)特異引物，從番茄基因組中分離了長(zhǎng)1790bp的Pds啟動(dòng)子序列，測(cè)序結(jié)果表明所分離的Pds啟動(dòng)子序列和GenBank中公布的一致。通過(guò)Sal I和BamH I酶切將全長(zhǎng)Pds

5、啟動(dòng)子插入到pVCT-2020表達(dá)載體中，替換掉該載體中GUS基因的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建成攜有Pds GUS基因表達(dá)盒的植物基因表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將Pds-GUS基因轉(zhuǎn)入番茄中，獲得的轉(zhuǎn)基因番茄的果實(shí)、葉片及根經(jīng)X-Gluc染色5h，70％7,醇脫色后，顯微鏡下觀察照相。結(jié)果表明Pds啟動(dòng)子具有果實(shí)特異性的特點(diǎn)。 2．番茄紅素環(huán)化酶(Lcy)基因的DNA片段的克隆，根據(jù)GenBank中公布的番茄紅素β環(huán)化酶基因(

6、Lcy-β)序列(X86452)設(shè)計(jì)特異引物，上游引物P166：CTATGGTGTTTGGGTGGATG，下游引物P167：GTGCTCGATGCAACTGGCTTCTCTA，通過(guò)PCR從番茄基因組中獲得了長(zhǎng)302bp的Lcy片段，測(cè)序結(jié)果表明與GenBank公布的一致。 3．果實(shí)特異性RNAi的植物表達(dá)載體的構(gòu)建通過(guò)Sal I酶切，補(bǔ)平，再用BamHI酶切后連接，得到Lcy片段反向重復(fù)連接的中間克隆載體 pMD-srLcy。將

7、pMD-srLcy經(jīng)BamH I酶切，去磷酸化后與內(nèi)含子連接，構(gòu)建RNAi片段的中間克隆載體pMD-RNAi。pMD-RNAi經(jīng)Sal I和Ecl136 Ⅱ切下RNAi片段插入到pVCT2020載體中，構(gòu)建成pVCT-RNAi表達(dá)載體。pMD-Pds經(jīng)Sal I和EcoRI切下Pds啟動(dòng)子后，將Pds片段插入到Sal I和EcoRI酶切的pVCT-RNAi載體中，構(gòu)建成pVCT-PdsRNAi載體。構(gòu)建成的pVCT-PdsRNAi表達(dá)載

8、體經(jīng)酶切鑒定，能獲得正確的目的帶，表明構(gòu)建的載體正確。 4．番茄遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立番茄種子經(jīng)肥皂水清洗2～3次，70％的乙醇消毒30s后，清水沖洗掉乙醇；然后在超凈臺(tái)上用10％的次氯酸鈉消毒30min，滅菌水漂洗4次后，接種于1/2MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2～3天，待番茄種子發(fā)芽后，于25℃，光照強(qiáng)度18001x，16h光/8h暗的光周期條件下培養(yǎng)直到子葉完全展開。切取番茄的子葉和下胚軸，分別接種到MS+1.0 mg/L 6-B

9、A+0.2 IBg/L IAA+3％蔗糖+6.5％瓊脂的固體培養(yǎng)基上，比較子葉和下胚軸的芽分化能力，結(jié)果表明子葉的芽分化能力高于下胚軸。 將番茄子葉接種到MS附加不同濃度6-BA(1～3 mg/L)與IAA(0.1～0.3 mg/L)及6-BA(1～3 mg/L)與NAA(0.1～0.3 mg/L)組合的培養(yǎng)基上，篩選適宜芽分化的激素濃度及最佳組合。結(jié)果表明在MS+1.0 mg/L6.BA+0.2 mg/L LAA+3％蔗糖+6

10、.5％瓊脂的培養(yǎng)基上番茄子葉的芽誘導(dǎo)率最高，并且誘導(dǎo)芽所需要的時(shí)間最短，長(zhǎng)出的芽最壯，因此本實(shí)驗(yàn)最終采用MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+3％蔗糖+6.5％瓊脂組合的培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)番茄子葉發(fā)芽。設(shè)計(jì)不同濃度的IAA(0.2～0.5mg/L)，觀察不定芽生根的速度、數(shù)量及生根的質(zhì)量，以確定適于番茄生根的最佳I從濃度，結(jié)果顯示幼苗在不同培養(yǎng)基中都能生根，其中以含0.4 mg/LIAA的培養(yǎng)基生根最快，一周后即出現(xiàn)大量不

11、定根，根系比較壯。 為了測(cè)定外植體對(duì)Kan的敏感性，在篩選的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，加入不同濃度的kan(0、10、20、30、40、50、60、70 mg/L)測(cè)定外植體的分化情況，每個(gè)濃度3次重復(fù)，每次重復(fù)20個(gè)外植體，接種觀察不同濃度kan對(duì)番茄子葉分化抑制的效果。結(jié)果表明當(dāng)在濃度為60 mg/L的培養(yǎng)基上，有少量愈傷組織形成，以后逐漸白化、死去，不能分化出芽；含40 mg/L kan．的培養(yǎng)基上多數(shù)外植體形成較多的愈傷組織，大

12、部分可分化出綠芽，并且生長(zhǎng)正常；因此本實(shí)驗(yàn)所用番茄材料適宜的篩選壓為kan 50ng/L。 5．轉(zhuǎn)基因番茄的獲得采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將攜帶pVCT-PdsRNAi表達(dá)載體的新鮮的農(nóng)桿菌菌液用液體MS培養(yǎng)基重懸后，浸染已經(jīng)在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)兩天的番茄子葉，將經(jīng)農(nóng)桿菌浸染的外植體接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+30g/L蔗糖+瓊脂6.5g/L)上28℃暗培養(yǎng)2d，然后將外植體轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基

13、(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+300mg/I，羧卞青霉素Cb，pH 5.8)上培養(yǎng)7天，然后把抑菌培養(yǎng)7d后的外植體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+30g/L蔗糖+瓊脂6.5g/L+50 mg/L kan+250 mg/L Cb，pH 5.8)上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度26±2℃，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度3，000lx。選擇培養(yǎng)2周后，

14、外植體的切口處逐漸分化出抗性不定芽，將這些抗性芽轉(zhuǎn)入(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+糖30 g/L+瓊脂6.5g/L+50 mg/L kan+200 mg/L Cb．pH 5.8)新鮮選擇培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行選擇培養(yǎng)，每?jī)芍軗Q一次培養(yǎng)基，其間不斷的降低Cb的濃度。待抗性苗長(zhǎng)到3～4cm以上時(shí)，從基部切下形成的不定芽，轉(zhuǎn)入MS+0.4 mg/L IAA+30 g/L 蔗糖+50 mg/L的Kan的培養(yǎng)基上生根，7

15、～10d后開始長(zhǎng)出不定根，等幼苗長(zhǎng)到3～4片葉后，將生根后的植株開瓶煉苗3～5d，移栽到人工氣候室中讓其自然生長(zhǎng)直到結(jié)果。 6．轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)通過(guò)抗性篩選，本實(shí)驗(yàn)共獲得了7株轉(zhuǎn)化再生植株，分別提取這7株植株的DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系同擴(kuò)增Lcy片段一樣，反應(yīng)條件只由72℃延伸1min變?yōu)?2℃延伸2min外，其他條件不變。其中5株擴(kuò)增出了預(yù)期的條帶，表明外源基因已經(jīng)整合到了番茄基因組中，將鑒定為正確的轉(zhuǎn)基因植株移栽到人工

16、氣候室中，讓其自然生長(zhǎng)直到結(jié)果，獲得轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)。在農(nóng)桿菌浸染過(guò)程中，農(nóng)桿菌太濃，在后來(lái)的培養(yǎng)中外植體容易褐化、壞死；農(nóng)桿菌太稀獲得的抗性植株的機(jī)會(huì)就減少，因此，應(yīng)適當(dāng)掌握農(nóng)桿菌的浸染濃度，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為農(nóng)桿菌菌液濃度的0D值在0.3～0.6之間是最適合浸染番茄外植體的濃度，同時(shí)用液體Ms培養(yǎng)基重懸農(nóng)桿菌是很必要的，可以降低農(nóng)桿菌對(duì)外植體的毒害，增加外植體的成活率。 7．轉(zhuǎn)基因番茄中番茄紅素含量的測(cè)定收獲轉(zhuǎn)色期20天后的完全紅

17、熟的番茄果實(shí)每株兩個(gè)，研磨成糊以后，每株稱取10g番茄糊，加入適量的氯仿在35~C避光提取4小時(shí)，離心，轉(zhuǎn)移下層液體至一新的50mL的離心管中，然后向番茄殘?jiān)性偌尤脒m量氯仿重復(fù)抽提2次，最后用氯仿定容到50mL。將提取的番茄紅素溶液迅速用U-1800型紫外分光光度計(jì)在502nm的波長(zhǎng)下測(cè)定番茄紅素含量<'[135]>，氯仿做參比，每個(gè)材料重復(fù)3次，測(cè)得一系列吸光度值，取平均值計(jì)算番茄紅素含量。測(cè)定結(jié)果表明所獲得的5株轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的番