磷酸二酯酶抑制劑對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：以大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷為動(dòng)物模型，觀察咯利普蘭(Rolipram)對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙的保護(hù)作用及己酮可可堿(Pentoxifylline，PTX)對(duì)腦缺血后海馬區(qū)新生細(xì)胞存活的影響，并在此基礎(chǔ)上探討磷酸二酯酶抑制劑的作用機(jī)制。體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元和PC12細(xì)胞，建立缺氧/再給氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)損傷模型，觀察咯利普蘭對(duì)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活力的影響。 方法：(1)咯利普蘭(1mg/kg)連續(xù)腹

2、腔給藥15d，參照LongaEZ線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。造模后d8、d13分別對(duì)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試訓(xùn)練和避暗測(cè)試。造模后d15，斷頭取腦并迅速取出海馬組織，制備成組織勻漿，應(yīng)用高效液相色譜分析(HPLC)法測(cè)定海馬組織磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)活性。(2)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元和PC12細(xì)胞，分別應(yīng)用物理、化學(xué)兩種方法建立細(xì)胞H/R損傷模型，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并且應(yīng)用四甲基偶氮唑

3、藍(lán)法(methylthiazolyltetrazolium，MTT)觀察不同濃度咯利普蘭對(duì)細(xì)胞活力的影響，測(cè)定細(xì)胞外液乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)濃度。(3)建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，造模9d后給予BrdU(50mg/kg)進(jìn)行標(biāo)記，4次/d，間隔2h給藥1次。標(biāo)記后d7腹腔注射不同劑量的PTX(20mg/kg或40mg/kg)，連續(xù)22d。在BrdU標(biāo)記后d30處死大鼠。取腦組織做冷凍切片，

4、行免疫組化法觀察PTX對(duì)大鼠缺血再灌注后腦組織海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞數(shù)的影響。 結(jié)果：(1)在Morris水迷宮測(cè)試中，各組大鼠在d1的潛伏期沒有顯著差異；d4與d7模型組大鼠的潛伏期明顯延長，分別為27.700±13.407s、14.540±4.408s；咯利普蘭顯著縮短了模型大鼠的尋臺(tái)時(shí)間，潛伏期分別為15.945±8.791s、10.347±3.940s。大鼠在Morris水迷宮中到達(dá)平臺(tái)的平均路程在d4與d7均有顯著

5、差異：模型組大鼠的泳程分別為262.078±181.067cm、139.873±31.063cm；咯利普蘭組的泳程為125.292±45.707cm、110.545±14.567cm較模型組顯著縮短。在避暗實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠的潛伏期顯著降低(110.563±61.817s)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(1.125±0.991次)；咯利普蘭顯著增加了模型大鼠的潛伏期(168.500±60.564S)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(0.750±0.707次)。通

6、過HPLC檢測(cè)分析得知：與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬組織PDE4活性顯著升高(34.338±7.974μmol/g/min)；與模型組相比，咯利普蘭組PDE4活性顯著降低(26.913±7.105μmol/g/min)。(2)結(jié)合海馬神經(jīng)元在倒置顯微鏡下的形態(tài)學(xué)特征及神經(jīng)微絲(NF200)抗原的鑒定結(jié)果，確認(rèn)分離培養(yǎng)的為神經(jīng)元。缺氧/再給氧損傷后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了一定的改變，咯利普蘭10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L

7、三個(gè)劑量均顯著降低了缺氧/再給氧損傷對(duì)PC12細(xì)胞及海馬神經(jīng)元造成的損傷：PC12細(xì)胞的A值由模型組的0.287±0.080增加到0.391±0.096、0.396±0.104、0.425±0.080；神經(jīng)元的A值由0.155±0.043增加到0.236±0.041、0.244±0.089、0.253±0.054。與模型組506.658±28.412相比，應(yīng)用咯利普蘭后PC12細(xì)胞各組細(xì)胞外液LDH也逐漸降低呈濃度依賴趨勢(shì)LDH分別為4

8、72.284±27.442、448.551±24.684、437.320±41.231；咯利普蘭顯著減少了海馬神經(jīng)元細(xì)胞外液LDH值，從模型組的531.790±70.054U/L分別減少為404.460±89.568U/L、399.372±88.476U/L、388.428±127.281U/L。(3)在倒置顯微鏡下觀察成年大鼠腦缺血損傷后海馬齒狀回BrdU免疫陽性細(xì)胞的分布。BrdU免疫陽性細(xì)胞表現(xiàn)為橢圓形或不規(guī)則形狀的細(xì)胞核，并呈現(xiàn)

9、明顯的“叢集”現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中陰性對(duì)照海馬齒狀回(Dentategyrus，DG)區(qū)未見BrdU免疫陽性細(xì)胞。BrdU給藥30d后，空白對(duì)照組大鼠DG區(qū)僅見少量散在的BrdU免疫陽性細(xì)胞，細(xì)胞百分比率為(100.000±18.365)，方差分析結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，模型組DG區(qū)BrdU免疫陽性細(xì)胞比率顯著增加為(129.358±18.378)，可可堿對(duì)照組免疫陽性細(xì)胞比率也有少量增加(108.217±15.743)；與模型組相比，P

10、TX20mg/kg、40mg/kg治療組BrdU免疫陽性細(xì)胞比率顯著增加，分別為(148.017±24.201、152.992±22.160)。 結(jié)論：磷酸二酯酶4抑制劑—咯利普蘭可顯著改善局灶性腦缺血再灌注損傷造成的學(xué)習(xí)記憶障礙，推測(cè)其作用機(jī)制與抑制損傷大鼠海馬區(qū)PDE4活性有關(guān)：PDE4活性降低使環(huán)磷腺苷(cyclicAdenosinemonophosphate，cAMP)水解減少，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，進(jìn)而活化蛋