大鼠缺氧缺血性腦損傷后海馬PI3K-Akt信號(hào)通路及PTEN的表達(dá)與認(rèn)知功能障礙相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型的建立及建模成功的鑒定
　　 目的:
　　 建立新生大鼠圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型,并鑒定模型是否建立成功。
　　 方法:
　　 選用新生7日齡SD大鼠40只,分為假手術(shù)組(n=18)和缺氧缺血模型(HIBD)組(n=22)。參照Rice法,并采用Nakajima等改良的動(dòng)脈結(jié)扎法制作新生大鼠HIBD動(dòng)物模型,即在乙醚麻醉下行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎并剪斷,置于通入氮氧混

2、合氣(92％N2、8％02)的缺氧箱中缺氧2h。假手術(shù)組只游離而不結(jié)扎剪斷左側(cè)頸總動(dòng)脈,不予缺氧處理。觀察缺氧缺血后24h內(nèi)大鼠神經(jīng)行為的變化,并于建模后72h處死,觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)改變。大鼠滿28日齡時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),觀察大鼠的學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知能力。
　　 結(jié)果:
　　 與假手術(shù)組相比,HIBD模型鼠的運(yùn)動(dòng)行為落后,大體解剖、Nissl染色均有明顯改變,水迷宮結(jié)果提示出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力障礙。
　

3、　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)所用方法建立的圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型成功可行,為進(jìn)一步研究提供了可靠的模型。
　　 第二部分大鼠缺氧缺血性腦損傷后海馬PI3K/Akt信號(hào)通路及PTEN的表達(dá)與分布
　　 目的:
　　 探討缺氧缺血條件下海馬區(qū)三磷酸肌醇激酶(phosphoinositid3-kinase/Akt,PI3K/Akt)信號(hào)通路的激活及PTEN的表達(dá),推測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路與PTEN表達(dá)

4、調(diào)節(jié)的關(guān)系,以期更確切地闡明PI3K/Akt信號(hào)通路在發(fā)育期腦缺氧缺血性損傷(hypoxia ischemia brain damage,HIBD)后的作用。
　　 方法:
　　 7日齡SD大鼠110只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=39)、假手術(shù)組(n=39)、實(shí)驗(yàn)組(n=32)。參照Rice法,并采用Nakajima等改良的動(dòng)脈結(jié)扎法制作新生大鼠HIBD動(dòng)物模型。假手術(shù)組只游離而不結(jié)扎剪斷左側(cè)頸總動(dòng)脈,不予缺氧處理。正常對(duì)

5、照組不作任何處理。于建模后4h處死動(dòng)物取腦組織應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)AKT、PTEN蛋白的分布和表達(dá);分別于建模后1、4、12及24 h處死動(dòng)物取腦組織,應(yīng)用Western blot檢測(cè)AKT、p-Akt及p-PTEN蛋白的含量。
　　 結(jié)果:
　　 腦缺氧缺血損傷后早期p-Akt和p-PTEN都有不同程度的表達(dá)增加,但不同步,其中p-Akt高峰較早,在4h,而p-PTEN的高峰稍延遲,在12小時(shí),與假手術(shù)組表達(dá)的比較均有差

6、異。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)p-Akt和p-PTEN均有極少量弱陽(yáng)性表達(dá)。HIBD模型組p-Akt蛋白表達(dá)在4h和12h時(shí)間點(diǎn)明顯高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);p-PTEN蛋白表達(dá)于4h,12h和24h明顯高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).AKT蛋白表達(dá)隨術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化,與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 發(fā)育期大腦HIBD后早期可激活PI3K/Akt

7、信號(hào)通路,p-Akt表達(dá)增高,但同時(shí)PTEN也被激活,從而抑制了p-Akt的表達(dá),最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷。期望能針對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路和PTEN尋找到防治新生兒HIBD的更好方法,為開發(fā)出以AKT/PTEN為靶點(diǎn)的神經(jīng)保護(hù)劑治療缺氧缺血腦病提供了理論依據(jù)。
　　 第三部分 PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)缺氧缺血性腦損傷大鼠認(rèn)知功能的影響
　　 目的:
　　 研究PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)缺氧缺血性腦損傷(HIBD

8、)大鼠學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能的影響。
　　 方法:
　　 于制備新生大鼠左腦HIBD模型前30min,應(yīng)用腦立體定位儀定位大鼠左側(cè)海馬區(qū),注射Wortmannin2μl,建立Wortmannin干預(yù)HIBD組,同時(shí)建立DMSO(Dimethyl sulfoxide)干預(yù)HIBD組、HIBD模型組,假手術(shù)組及空白對(duì)照組。于建模后4h處死動(dòng)物取腦組織,應(yīng)用Western blot檢測(cè)p-Akt蛋白表達(dá)情況。于大鼠28日齡時(shí)用Mo

9、rris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 結(jié)果:
　　 HIBD后4小時(shí),Wortmannin干預(yù)HIBD組的p-Akt蛋白的表達(dá)明顯下降,與DMSO干預(yù)HIBD組及HIBD模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。28d后,空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠的水迷宮數(shù)據(jù)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),HIBD組和DMSO干預(yù)HIBD組大鼠的數(shù)據(jù)之間也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差(P＞0.05),但Wortmannin干預(yù)HIBD

10、組的學(xué)習(xí)記憶能力顯著低于HIBD組和DMSO干預(yù)照HIBD組(P＜0.05),同時(shí)非常顯著低于假手術(shù)組和空白對(duì)照組(P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 PI3K/Akt信號(hào)通路是一個(gè)經(jīng)典的抗凋亡、促存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,對(duì)缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起重要的調(diào)控作用。應(yīng)用Wortmannin(PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑)可以加重HIBD新生鼠神經(jīng)細(xì)胞的損傷,進(jìn)而加重其認(rèn)知功能障礙,從而影響遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功