PGHS-2在早產(chǎn)中的表達(dá)及意義研究.pdf

1、早產(chǎn)是常見的妊娠并發(fā)癥,占整個(gè)妊娠的5％～15％,占新生兒死亡的70％,新生兒病率的75％。多年來早產(chǎn)的發(fā)生率并未降低,目前臨床上尚無可靠預(yù)測早產(chǎn)的診斷指標(biāo),也缺乏有效的治療措施。目前對早產(chǎn)的研究大部分仍致力于闡明分娩的發(fā)生機(jī)制,特別是分娩發(fā)動過程中的生化改變,希望借以找到更好的預(yù)測和治療早產(chǎn)的有效方法。
　　 前列腺素可以改變胎膜結(jié)構(gòu)、促進(jìn)宮頸成熟和引發(fā)子宮收縮,是分娩發(fā)生的最重要的刺激因素。PGHS-2是前列腺素合成的限速酶

2、,它將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎厍绑w-PGG2或PGH2,從而形成各種形式的前列腺素、前列環(huán)素、血栓烷。PGHS-2是一種誘導(dǎo)型分子,它的表達(dá)受到嚴(yán)密的調(diào)控,在外界刺激因素如IL-1β、LPS等作用下,細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號通路如MAPK、NFκB被激活,從而活化轉(zhuǎn)錄因子,后者進(jìn)入細(xì)胞核,與細(xì)胞核中的調(diào)控元件結(jié)合從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。PGHS-2表達(dá)上調(diào)的調(diào)節(jié)機(jī)制較復(fù)雜,不同類型的組織,不同類型的刺激,PGHS-2表達(dá)調(diào)控機(jī)制差別明顯。在妊娠期PGHS-

3、2主要存在于子宮平滑肌細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞,分別具有誘發(fā)分娩和維持妊娠的作用。隨著分娩的臨近及發(fā)動,IL-1β等炎癥因子激活MAPK及NFκB信號,引起PGHS-2表達(dá)顯著上調(diào),前列腺素合成增加,刺激子宮肌細(xì)胞收縮,導(dǎo)致分娩的發(fā)生。早產(chǎn)是由各種因素引起的分娩的過早發(fā)動,即子宮由靜息期向激活期的過早轉(zhuǎn)化,因此,PGHS-2的表達(dá)及其調(diào)控特點(diǎn)在早產(chǎn)和足月產(chǎn)可能存在差異。本研究通過對PGHS-2在早產(chǎn)子宮肌中的表達(dá)和調(diào)控特點(diǎn)進(jìn)行初步探討,為進(jìn)一

4、步揭示早產(chǎn)發(fā)生機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。
　　 為了明確早產(chǎn)中PGHS-2的表達(dá)及調(diào)控特點(diǎn),本研究選取早產(chǎn)臨產(chǎn)(PTL)與未臨產(chǎn)(PTNL)孕婦做為研究組,足月臨產(chǎn)(TL)與未臨產(chǎn)(TNL)孕婦做為對照組,活檢取子宮下段肌層組織,免疫組化-免疫熒光對PGHS-2在子宮肌中的表達(dá)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)及Western blot法檢測子宮肌層中PGHS-2、IL-8、OTR等分娩相關(guān)因子mRNA及蛋白的

5、表達(dá),通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測子宮肌層中前列腺素PGE2的含量,并結(jié)合臨床資料對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。同時(shí),分我們通過Western blot分析早產(chǎn)子宮肌層組織中PGHS-2相關(guān)信號通路MAPK及NFκB蛋白分子的表達(dá),通過分離培養(yǎng)子宮平滑肌細(xì)胞,觀察前列腺素對NF-κB的表達(dá)及激活的影響。
　　 我們隨機(jī)選取西南醫(yī)院2008年7月～2010年4月剖宮產(chǎn)分娩的妊娠32～36+6周早產(chǎn)孕婦及同期37～41+6周足

6、月孕婦80例。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)及Western blot法檢測了子宮肌層中PGHS-2、IL-8、OTR等分娩相關(guān)因子mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,PGHs-2 mRNA及蛋白水平在早產(chǎn)與正常足月產(chǎn)存在顯著的差異,在早產(chǎn)妊娠時(shí)明顯高于足月產(chǎn)妊娠,而在早產(chǎn)臨產(chǎn)時(shí),其在子宮肌層中的表達(dá)又明顯低于足月臨產(chǎn)。我們的結(jié)果提示早產(chǎn)子宮平滑肌中PGHS-2的表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)可能與足月產(chǎn)中存在差異。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢

7、測早產(chǎn)未臨產(chǎn)和足月未臨產(chǎn)子宮肌層中前列腺素PGE2的含量。結(jié)果顯示在早產(chǎn)未臨產(chǎn)和足月未臨產(chǎn)中PGE2都有表達(dá),且前者顯著高于后者,提示早產(chǎn)未臨產(chǎn)中PGHS-2的上調(diào)可以促進(jìn)PGE2的合成增加。我們?nèi)⌒迈r的早產(chǎn)未臨產(chǎn)及足月未臨產(chǎn)子宮肌層組織,對磷酸化的JNK1/2/3、p38、ERK1/2激酶的水平以及NFκB p65以及。IkBa蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了Western blot檢測。結(jié)果顯示,在早產(chǎn)未臨產(chǎn)子宮肌層組織中,MAPK信號通路中的

8、JNK1/2/3與p38激酶的磷酸化水平顯著高于足月未臨產(chǎn),而ERK1/2的磷酸化水平與之未見顯著差別。NFκB p65以及IkBa的表達(dá)水平在早產(chǎn)與足月產(chǎn)之間未見顯著差異,提示PGHS-2表達(dá)的上調(diào)可能是通過MAPK信號通路中的JNK1/2/3與p38實(shí)現(xiàn)的。為了分離培養(yǎng)及鑒定子宮平滑肌細(xì)胞的,取新鮮的子宮肌層組織,用眼科小剪刀反復(fù)切碎組織為2mm×2mm×2mm大小,將組織吸入離心管,加入培養(yǎng)液5ml(含0.2％膠原酶Ⅱ),37℃水

9、浴振蕩消化約12～16h。離心去上清液,加含20％FBS的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/ml及鏈霉素0.1mg/ml)吹打混勻后接種細(xì)胞培養(yǎng)板,37℃5％CO2培養(yǎng)箱靜置1～2d,細(xì)胞伸展貼壁呈梭形生長,約8～10d細(xì)胞達(dá)到90％融合時(shí),即可傳代。激光共聚焦顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞中α-actin的表達(dá)。結(jié)果顯示,我們分離培養(yǎng)的子宮平滑肌細(xì)胞貼壁生長,呈梭形,顯著表達(dá)α-actin蛋白,提示分離培養(yǎng)成功。為了檢測PGE2對子宮肌細(xì)胞NF

10、-κB信號通路的影響,首先用PGE2刺激子宮平滑肌細(xì)胞8h、16h、24h,Western blot檢測細(xì)胞中NFκB p65蛋白的表達(dá);然后用IL-1β和LPS分別去刺激用PGE2刺激或沒有刺激的子宮平滑肌細(xì)胞,激光共聚焦觀察NFκB p65的核轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示PGE2能夠明顯抑制NFκB p65蛋白的表達(dá),在16h時(shí)最顯著。PGE2能夠顯著抑制由IL-1β和LPS刺激引起的NFκB p65分子向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移,提示PGE2在體外能顯著