FTL重組蛋白的純化及其在常見消化道癌診斷中的價(jià)值.pdf

1、背景和目的：近年來，消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)，并且部分腫瘤如胃癌、肝癌、胰腺癌等的預(yù)后較差，已成為嚴(yán)重威脅人類生命和健康的重大疾病之一。目前臨床上常用的血清標(biāo)志物敏感性或特異性均不夠理想，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)某一種腫瘤的早期準(zhǔn)確診斷。因此尋找提高消化道腫瘤早期診斷率的高效特異性生物標(biāo)志物不僅具有重要的臨床意義，而且勢(shì)在必行。目前的研究顯示，在慢性炎癥性疾病如肝炎、肝硬化等發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的過程中，機(jī)體可產(chǎn)生針對(duì)自身腫瘤相關(guān)抗原

2、的抗體，并且一些自身抗體在發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化前就可在患者血清中檢測(cè)到，這為惡性腫瘤的早期診斷提供了新的思路。
　　 鐵蛋白輕鏈(ferritin light polypeptide，F(xiàn)TL，)是鐵蛋白的一種亞基，主要參與機(jī)體細(xì)胞內(nèi)鐵的儲(chǔ)藏與轉(zhuǎn)運(yùn)。研究顯示，鐵蛋白在多種惡性腫瘤患者血清中的含量顯著高于正常人血清中的含量，提示鐵蛋白可能是一種血清腫瘤標(biāo)志物。本課題組前期已成功構(gòu)建好含有目的基因的測(cè)序正確的重組子pET30α-FTL。本研究

3、將重組子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，通過原核表達(dá)的方法獲得FTL重組蛋白，并用其作為腫瘤相關(guān)抗原檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者、慢性肝病患者、食管癌患者、胃癌患者及正常人血清內(nèi)抗FTL抗體的水平，評(píng)價(jià)其作為消化系統(tǒng)癌癥診斷指標(biāo)的價(jià)值，為進(jìn)一步聯(lián)合其他腫瘤相關(guān)抗原診斷某一消化系統(tǒng)惡性腫瘤的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.將含有目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21中。
　　 2.確定最佳誘導(dǎo)條件：確定IP

4、TG誘導(dǎo)目的蛋白最佳表達(dá)濃度和最佳表達(dá)時(shí)間。
　　 3.大量誘導(dǎo)表達(dá)：誘導(dǎo)的菌體經(jīng)超聲破碎后進(jìn)行可溶性分析確定FTL重組蛋白的表達(dá)形式，并盡可能優(yōu)化誘導(dǎo)條件增加可溶性蛋白的表達(dá)量。
　　 4.蛋白純化：通過鎳離子親和層析法純化帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白，測(cè)定純化蛋白的濃度，并用Western blot鑒定重組蛋白。
　　 5.通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)正常人、慢性肝炎及常見消化道癌癥(原發(fā)性肝癌、食

5、管癌、胃癌)患者血清中的FTL抗體含量，比較其在正常人、慢性肝炎及常見消化道癌癥(原發(fā)性肝癌、食管癌、胃癌)患者血清中的水平。
　　 6.以正常人血清中FTL抗體含量的百分位數(shù)P95作為截?cái)嘀?，?jì)算消化系統(tǒng)各種癌癥組、慢性肝病組和正常組FTL抗體陽(yáng)性率，并使用篩檢試驗(yàn)的評(píng)價(jià)方法來評(píng)價(jià)FTL檢測(cè)消化系統(tǒng)癌癥的診斷價(jià)值。
　　 結(jié)果：成功轉(zhuǎn)化了重組表達(dá)質(zhì)粒，尋找到目的蛋白大量表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件為0.05mmol/L IPTG

6、誘導(dǎo)5h；目的蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在：通過鎳離子親和層析法獲得到純化蛋白，并通過Western blot確定了純化的重組蛋白的免疫學(xué)活性。
　　 ELISA結(jié)果顯示，消化系統(tǒng)癌癥患者血清中的FTL抗體水平高于慢性肝病患者和正常人血清中的FTL抗體水平；FTL檢測(cè)原發(fā)性肝癌、食管癌、胃癌患者的靈敏度分別為17.6％、14.0％、12.0％，而在正常人及慢性肝病組中的靈敏度僅為5.1％、9.8％，這說明單獨(dú)使用FTL抗體作