大菱鲆幼魚對不同蛋白源營養(yǎng)感知與應(yīng)答機(jī)制的初步研究.pdf

1、本研究以我國北方重要海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)為實(shí)驗(yàn)對象,在室內(nèi)長流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行攝食生長實(shí)驗(yàn),研究不同動(dòng)植物蛋白源替代魚粉蛋白對大菱鲆幼魚生長性能、飼料利用及生理生化指標(biāo)的影響。并在此基礎(chǔ)上探討魚類對植物蛋白源耐受性差的分子機(jī)制。
　　1、不同動(dòng)植物蛋白源部分替代飼料魚粉蛋白對大菱鲆幼魚生長特性、血漿生化指標(biāo)及組織游離氨基酸含量的影響
　　本實(shí)驗(yàn)以初始體重(9.19±0.01

2、 g)的大菱鲆幼魚為研究對象,通過30天的攝食生長實(shí)驗(yàn),旨在比較研究不同動(dòng)植物蛋白源替代飼料魚粉對大菱鲆幼魚生長,體組成,血漿生化指標(biāo)及血漿和肌肉游離氨基酸含量的影響。共設(shè)計(jì)六組等氮等能的實(shí)驗(yàn)飼料,以魚粉組(FM)作為對照組,分別以豆粕(SB)、玉米蛋白粉(CG)、肉骨粉(MB)以及三種蛋白源等蛋白混合物(Mix)替代FM組45％魚粉蛋白設(shè)計(jì)四個(gè)替代組;另外,以FM組飼料氨基酸組成為標(biāo)準(zhǔn),在豆粕替代45%魚粉蛋白后補(bǔ)充必需氨基酸(EAA

3、)至對照組水平,設(shè)計(jì)添加限制性氨基酸組(SB+AA)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)40尾魚,每天2次飽食投喂。
　　研究表明,與FM組比,四個(gè)替代組均顯著降低大菱鲆幼魚特定生長率、攝食量、蛋白質(zhì)和脂肪滯留率(P<0.05),且均以CG組最低,其它三組組間差異不顯著;SB+AA組以上各指標(biāo)較SB組有一定程度提高,但差異不顯著(P>0.05)。除Mix組外,另四個(gè)實(shí)驗(yàn)組均較FM組全魚粗脂肪含量顯著降低(P<0.05)。各替代組血漿葡萄糖

4、(GLU)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TCHO)含量均不同程度低于FM組。非魚粉蛋白源替代魚粉后均顯著降低血漿某幾種游離必需氨基酸含量,且與蛋白源限制性氨基酸種類相關(guān);而添加限制性氨基酸后可大大改善血漿FAA含量及平衡性。除CG和MB組血漿游離TEAA和TAA顯著低于FM組(P<0.05)外,其它各組與FM組差異不顯著。肌肉游離EAA降低幅度和不平衡性大于血漿,表現(xiàn)為五替代組的TEAA、TNEAA和TAA均顯著低于對照組(P<0.05

5、),以CG組最低。SB+AA組較SB組可一定程度改善肌肉游離必需氨基酸含量,但與SB組差異不顯著(P>0.05),但是添加包膜Met使其含量顯著高于FM組(P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三種蛋白源單獨(dú)或復(fù)合替代45%魚粉蛋白均顯著抑制生長,降低飼料效率,影響魚體營養(yǎng)物質(zhì)的組成及代謝狀況,降低組織游離氨基酸平衡性和總量。另外,當(dāng)替代組飼料中添加限制性氨基酸可一定程度改善豆粕蛋白源氨基酸的不平衡。
　　2、豆粕部分替代飼料魚粉蛋白對

6、大菱鲆幼魚組織游離氨基酸含量,及小肽和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化的影響
　　選擇生長實(shí)驗(yàn)中的FM組、SB組和SB+AA組三個(gè)處理組為本章三個(gè)不同處理,旨在研究豆粕替代魚粉蛋白,對大菱鲆幼魚攝食后血漿和肌肉組織游離氨基酸動(dòng)態(tài)變化,氨基酸分解代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá),以及腸和肌肉小肽和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化的影響。各飼料飽食投喂大菱鲆幼魚30天,禁食48h后重新投喂相應(yīng)飼料,分別在0 h(禁食)、2 h、8 h和24 h取

7、樣。以后各章實(shí)驗(yàn)條件及樣品采集同本章。
　　結(jié)果表明,攝食促進(jìn)腸對氨基酸的吸收,血漿各游離必需氨基酸(EAA)含量在2 h或8 h達(dá)最大值(P<0.01),肌肉各游離EAA含量在8 h或24 h達(dá)最大值(P<0.01)。不同處理組間同一氨基酸存在峰值時(shí)間不一致的現(xiàn)象,如血漿中Thr和His,肌肉中Thr、Val、Ile等。與FM組比,SB組不同程度降低血漿和肌肉的單一和總游離 EAA的含量,且肌肉各游離 EAA的降低幅度和不平衡性

8、更大(P<0.05);而SB+AA組血漿FAA含量與FM組差異不顯著(P>0.05),但SB+AA組肌肉FAA稍高于SB組,顯著低于FM組。攝食SB組飼料較FM組腸和肌肉支鏈氨基酸分解關(guān)鍵酶BCKD-E2表達(dá)量均顯著升高。攝食后,腸PepT1在2h顯著升高,各處理組間差異不顯著。攝食顯著降低腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體B0AT1, SNAT2、TAT1、PAT1、b0,+AT和CAT2的基因表達(dá),提高ASCT2、LAT2和y+LAT1的表達(dá)量(P<

9、0.05);肌肉中,攝食降低LAT2和CAT2的表達(dá)量,而提高其它氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)豐度(P<0.05)。豆粕替代魚粉顯著提高腸B0AT1的表達(dá)(P<0.05),以及肌肉B0AT1、SNAT2、LAT2、TAT1、PAT1和y+LAT1的表達(dá)量(P<0.01);添加限制性氨基酸可一定程度降低氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)量,其中肌肉SB+AA組的LAT2、TAT1和PAT1與FM組差異不顯著。以上實(shí)驗(yàn)表明,豆粕與魚粉的氨基酸存在吸收動(dòng)力學(xué)差異,豆

10、粕替代飼料中的魚粉蛋白降低大菱鲆血漿和肌肉中FAA含量及平衡性,從而加劇肌肉中EAA的氧化消耗;另外,飼料中添加的限制性氨基酸吸收速度較飼料中結(jié)合態(tài)氨基酸快,存在不同步現(xiàn)象,因此不能被有效利用。腸和肌肉中的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體在攝食后動(dòng)態(tài)學(xué)變化不同,說明受不同機(jī)制調(diào)控。當(dāng)大菱鲆幼魚攝食添加豆粕的飼料后上調(diào)了主要氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)量,說明在氨基酸受限的情況下,魚體通過上調(diào)載體量促進(jìn)氨基酸的吸收。
　　3、豆粕部分替代飼料魚粉蛋白對大菱鲆

11、幼魚營養(yǎng)感知 AAR和 TOR信號通路的影響
　　選擇生長實(shí)驗(yàn)中的FM組、SB組和SB+AA組三個(gè)處理組為本章三個(gè)不同處理,旨在研究豆粕替代魚粉蛋白,對大菱鲆幼魚兩條重要的生長調(diào)節(jié)信號通路:氨基酸應(yīng)答信號通路(AAR)和雷帕霉素靶蛋白信號通路(TOR)的影響。研究表明,攝食抑制AAR信號通路,表現(xiàn)為攝食后腸、肌肉和肝臟中P-eIF2α和ATF4總蛋白表達(dá)量均大大降低。腸和肌肉中ATF4 mRNA表達(dá)量在攝食后均有升高,轉(zhuǎn)錄因子AT

12、F4依賴的ATF3、ASNS和CHOP表達(dá)量在攝食后顯著升高(P<0.05),而REDD1和4E-BP1表達(dá)量在攝食后顯著降低(P<0.05)。與FM組相比,豆粕替代魚粉后極大提高P-eIF2α和ATF4總蛋白表達(dá)量;SB組顯著提高腸ASNS、CHOP、REDD1和4E-BP1表達(dá)量(P<0.05);極顯著提高肌肉GCN2 mRNA表達(dá)量及轉(zhuǎn)錄因子ATF4依賴的基因轉(zhuǎn)錄(P<0.01),而SB+AA組基因表達(dá)量介于其它二組之間。攝食激活

13、TOR信號通路,表現(xiàn)為攝食提高信號通路上游Akt、TOR本身及下游S6和4E-BP1的磷酸化水平,均在2h快速升高,8 h后快速降低。與魚粉組相比, SB組和SB+AA組均抑制了肌肉和肝臟中四種信號傳導(dǎo)蛋白的磷酸化水平。肌肉和肝臟中Akt、TOR和S6的總蛋白表達(dá)量不受攝食時(shí)間和攝食飼料種類的影響(P>0.05),而4E-BP1總蛋白表達(dá)量受攝食和飼料影響(P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)表明,魚體內(nèi),隨攝食后機(jī)體循環(huán)庫營養(yǎng)因子水平升高,AAR

14、信號通路被抑制,而TOR信號通路被激活。與FM組相比,豆粕替代魚粉后激活了AAR信號通路,而大大抑制了TOR信號通路活性。添加限制性氨基酸可以一定程度抑制AAR信號通路活性,而對TOR信號通路作用不大。攝食植物蛋白源飼料后兩條通路共同抑制體內(nèi)總體蛋白質(zhì)的合成,且兩條通路相互調(diào)節(jié),使動(dòng)物在不利條件下存活。
　　4、豆粕部分替代飼料魚粉蛋白對大菱鲆幼魚糖脂代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響
　　選擇生長實(shí)驗(yàn)中的FM組、SB組和SB+AA組

15、三個(gè)處理組為本章三個(gè)不同處理,旨在研究豆粕替代魚粉蛋白,對大菱鲆幼魚肝臟糖脂代謝和肌肉脂肪合成的影響。研究表明,攝食后血漿TG含量顯著升高。而攝食不同飼料顯著影響血漿GLU、TG、TCHO的含量,表現(xiàn)為FM組顯著高于SB和SB+AA組。肝臟糖酵解途徑關(guān)鍵酶基因GK和PK在攝食后顯著升高,FM組GK表達(dá)量顯著高于SB組和SB+AA組, FM組和SB+AA組PK表達(dá)量均顯著高于SB組。肝臟糖異生途徑關(guān)鍵酶基因FBPase和G6Pase2在攝

16、食后顯著降低, FM組二基因表達(dá)量均顯著高于SB組和SB+AA組。肝臟脂肪酸合成途徑關(guān)鍵酶基因(SREBP-1、FAS、PPARγ、G6PD),甘油三酯和膽固醇酯合成途徑關(guān)鍵酶基因(DGAT1、DGAT2、SOAT2)表達(dá)量均在攝食后均顯著升高,FM組四個(gè)基因表達(dá)量均顯著高于SB和SB+AA組。且肌肉脂肪合成途徑關(guān)鍵酶基因SREBP-1、FAS和DGAT1表達(dá)量也在攝食后顯著升高, FM組三個(gè)基因表達(dá)量均顯著高于SB組和SB+AA組。肝

17、臟中脂肪酸氧化途徑關(guān)鍵酶基因CPT1a和ACOX1表達(dá)量在攝食后顯著升高,但不受攝食飼料種類影響。綜上,攝食顯著促進(jìn)大菱鲆幼魚肝臟糖酵解和機(jī)體脂肪合成,但抑制肝臟糖異生過程,對脂肪酸氧化的影響不顯著。當(dāng)大菱鲆攝食添加豆粕的飼料后,較FM組顯著抑制機(jī)體脂肪合成過程,且血漿TG、TCHO變化與之一致,這也是攝食植物蛋白源導(dǎo)致魚體粗脂肪含量和脂肪沉積率降低的分子機(jī)制。另外,豆粕替代魚粉顯著降低肝臟糖酵解和糖異生過程,且血糖變化與之一致,因此攝