日糧營養(yǎng)水平對山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡和自噬的影響.pdf

1、本研究包括三個部分:1、日糧精料水平對山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡和自噬的影響;2、饑餓對山羊瘤胃上皮細(xì)胞自噬和凋亡的影響;3、體外研究pH和SCFA對原代培養(yǎng)山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡和自噬的影響。
　　1.日糧精料水平對山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡和自噬的影響
　　將15只裝有永久性瘤胃瘺管的青年雜交山羊（波爾山羊×淮南羊）分為精料組(HC組，n=9)和粗料組（HF組，n=6），單圈飼養(yǎng)，自由飲水，兩組山羊每天飼喂兩次，時間點分別是8:00和

2、17:00，飼喂80天后采樣。山羊屠宰后檢測表明，HC組山羊終體重、瘤胃干重、5×5cm2瘤胃上皮重均顯著高于HF組(P＜0.05); HC組山羊瘤胃液pH顯著低于HF組(P＜0.01);運用氣相色譜方法檢測瘤胃液SCFA，結(jié)果顯示HC組山羊瘤胃液中，TSCFA、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、正戊酸及異戊酸的濃度均顯著高與HF組(P＜0.01);Real-time Q-PCR方法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53、Bcl-2、Bax、Caspase

3、3及Caspase9的表達(dá)，結(jié)果顯示HC組山羊瘤胃上皮p53、Bcl-2、Bax、Caspase3和Caspase9的mRNA表達(dá)水平顯著高于HF組（P＜0.05），Bcl-2/Bax的值在HC組和HF組之間無顯著差異（P＞0.05）;Real-time Q-PCR方法檢測細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin1和Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果顯示HC組山羊瘤胃上皮Bcl-2的mRNA表達(dá)水平顯著高于HF組，Beclin1的mRNA表達(dá)水平在HC組和HF

4、組之間無顯著差異（P＞0.05）;TUNEL凋亡檢測結(jié)果顯示，HC組山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于HC組(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，提高日糧精料水平能夠誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時還可以抑制瘤胃上皮細(xì)胞的自噬。
　　2.饑餓對山羊瘤胃上皮細(xì)胞自噬和凋亡的影響
　　將13只裝有永久性瘤胃瘺管的青年雜交山羊（波爾山羊×淮南羊）分為非饑餓組（NS組，n=4），饑餓16h組（SS組，n=4）和饑餓3天以上組（LS組，n=

5、5），單圈飼養(yǎng)，自由飲水，自由采食花生桿。每天8:00、11:00、14:00和17:00分別飼喂精料100 g，飼喂42天后開始禁食采樣。山羊瘤胃pH結(jié)果顯示SS組和LS組均顯著高于NS組（P＜0.05），LS組顯著高于SS組（P＜0.05）;運用氣相色譜方法檢測瘤胃液SCFA，結(jié)果顯示山羊瘤胃TSCFA、乙酸、丙酸和丁酸濃度SS組和LS組均顯著低于NS組(P＜0.05)，LS組山羊瘤胃TSCFA和丁酸濃度均顯著低于SS組(P＜0.0

6、5)，乙酸和丙酸濃度在LS組和SS組之間無顯著差異（P＞0.05）;透射電鏡下發(fā)現(xiàn)饑餓條件下瘤胃上皮細(xì)胞中出現(xiàn)了細(xì)胞核形態(tài)異常、線粒體輕度腫脹、細(xì)胞質(zhì)中有散在的自噬泡等現(xiàn)象;Real-time Q-PCR方法檢測細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin1和Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果顯示: SS組山羊瘤胃上皮Beclin1的mRNA表達(dá)水平顯著高于NS組(P＜0.05)，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平與NS組相比無顯著差異（P＞0.05），LS組山羊瘤胃上

7、皮Beclin1的mRNA表達(dá)水平顯著高于NS組(P＜0.05)，但Bcl-2的mRNA表達(dá)水平顯著低于NS組(P＜0.05)，LS組山羊瘤胃上皮Bcl-2的mRNA表達(dá)水平顯著低于SS組(P＜0.05)，Beclin1的mRNA表達(dá)水平與SS組相比無顯著差異（P＞0.05）;Real-timeQ-PCR方法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53、Bcl-2、Bax、Caspase3及Caspase9的表達(dá)，結(jié)果顯示:SS組山羊瘤胃上皮Bax的mR

8、NA表達(dá)水平顯著高于NS組(P＜0.05)，而Bcl-2/Bax的比值卻顯著低于NS組(P＜0.05)，同時p53、Bcl-2、Caspase3和Caspase9的mRNA表達(dá)水平與NS組相比無顯著差異（P＞0.05）;LS組山羊瘤胃上皮p53的mRNA表達(dá)水平顯著高于NS組，但Bcl-2的mRNA表達(dá)水平則顯著低于NS組(P＜0.05)，同時Bax、Caspase3、Caspase9 mRNA的表達(dá)水平與Bcl-2/Bax的比值在LS

9、組與NS組間無顯著差異(P＞0.05);LS組山羊瘤胃上皮Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)水平顯著低于SS組(P＜0.05)，而Bcl-2/Bax的比值顯著高于SS組(P＜0.05)，同時p53、Caspase3和Caspase9的mRNA表達(dá)水平與SS組相比無顯著差異（P＞0.05）;Western blot法檢測LC3、ERK、pERK、AKT和pAKT蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，LS組出現(xiàn)了兩條清晰條帶LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，而SS

10、組出現(xiàn)了一條清晰的條帶LC3-Ⅰ和一條模糊的條帶LC3-Ⅱ，同時NS組只出現(xiàn)了一條帶LC3-Ⅰ;SS組和LS組pERK/ERK比率均顯著高于NS組(P＜0.05)，但pERK/ERK比率在LS組和SS組之間無顯著差異(P＞0.05); SS組和LS組pAKT/AKT比率均顯著低于NS組(P＜0.05)，pAKT/AKT比率在LS組和SS組之間無顯著差異(P＞0.05)。上述結(jié)果表明，饑餓能夠誘導(dǎo)瘤胃上皮細(xì)胞的自噬，同時還能促進瘤胃上皮細(xì)

11、胞的凋亡。
　　3.體外研究pH和SCFA對原代培養(yǎng)山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡和自噬的影響
　　山羊瘤胃上皮細(xì)胞經(jīng)24 h培養(yǎng)后分為8組:第一組加入pH7.4的DMEM(n=4)，第二組pH7.4+20 mM SCFA的DMEM(n=4)，第三組pH7.4+40 mM SCFA的DMEM(n=2)，第四組pH6.8的DMEM(n=4)，第五組pH6.8+20 mM SCFA的DMEM(n=4)，第六組pH6.8+40 mM SCF

12、A的DMEM(n=2)，第七組pH6.4的DMEM(n=4)，第八組pH6.4+20 mM SCFA的DMEM(n=4)。處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后對細(xì)胞進行收集。Real-time Q-PCR方法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53、Bcl-2、Bax、Caspase3及Caspase9的表達(dá)，結(jié)果提示低pH處理能促進瘤胃上皮細(xì)胞凋亡，而增加SCFA可以抑制瘤胃上皮細(xì)胞凋亡;Real-time Q-PCR方法檢測細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin1和B