SENP1表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤病情進(jìn)展的關(guān)聯(lián)及作用機制的初探.pdf

1、目的:檢測SUMO特異性蛋白酶1(SENP1)在正常組織及不同級別星型膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與病情進(jìn)展的關(guān)聯(lián)，采用RNA干擾技術(shù)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG中敲低SENP1的表達(dá)，研究其對U87MG細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的分子調(diào)控機制。
　　方法:采用RT-qPCR和Western blotting方法檢測SENP1在正常對照（3例）及星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤（28例）標(biāo)本中mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)差異。設(shè)計并合成特異性

2、針對SENP1基因的siRNA，按照2.5×105個/孔、體積2ml接種U87MG細(xì)胞于6孔板中，12h后轉(zhuǎn)染si-NC(對照組)、si-1、si-2(敲低SENP1組)，待細(xì)胞融合度達(dá)90％以上后，使用Lipofectamine2000(Invitrogen，USA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，采用RT-qPCR和Western blotting方法檢測SENP1的mRNA和蛋白表達(dá)情況。同時在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG沉默SENP1后應(yīng)

3、用Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)雙染色法在流式細(xì)胞儀上通過檢測細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸(PS)評估凋亡細(xì)胞的數(shù)量。最后，在U87MG細(xì)胞中敲低SENP1，通過蛋白印跡實驗檢測胞內(nèi)IκBα、p38的蛋白表達(dá)情況和二者的磷酸化水平，以及通路下游靶因子p65和bcl-2蛋白水平的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:通過qPCR檢測收集的31例腦組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn):與正常腦組織相比，人腦星型膠質(zhì)瘤中SENP1的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0

4、.05），其隨著腫瘤惡性程度的增高而增高，在高級別星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤(Ⅲ，Ⅳ級，WHO)中增高的水平更為顯著(P＜0.01）;通過蛋白印跡實驗從蛋白水平檢測SENP1在正常組織和不同級別之間蛋白水平的差異，結(jié)果顯示其與mRNA水平類似。轉(zhuǎn)染SENP1 siRNA后，U87MG細(xì)胞SENP1 mRNA表達(dá)受到抑制(P＜0.01)，蛋白表達(dá)水平降低。通過細(xì)胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，與si-NC(對照組)相比、轉(zhuǎn)染si-1、si-2(敲低SENP1組)的U

5、87MG細(xì)胞，其凋亡明顯增加，凋亡率統(tǒng)計學(xué)分析與對照組相比顯著增加(P＜0.05)。在U87MG細(xì)胞中敲低SENP1，通過蛋白印跡實驗檢測分析IκBα、p65和bcl-2在蛋白水平的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IκBα蛋白在兩種細(xì)胞株中的表達(dá)水平無變化，與對照組相比，IκBα的磷酸化水平明顯降低且其下游靶因子p65和抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)亦隨之降低，而在U87MG細(xì)胞中敲低SENP1后檢測p38 MAPK通路的激活情況，p38的磷酸化水平?jīng)]有發(fā)生