前列腺素EP3受體剪接體亞型在膽管細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用以及上調(diào)β-Catenin蛋白表達的分子機制研究.pdf

1、研究背景:
　　前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)是環(huán)加氧酶COX-2轉(zhuǎn)化花生四烯酸的產(chǎn)物，是一種炎性介質(zhì)，可促進多種腫瘤細(xì)胞的生長與侵襲，其中包括膽管細(xì)胞癌。PGE2可以與四種EP受體(E prostanoid receptor，EPR)結(jié)合，分別為EP1，EP2，EP3和EP4受體，從而影響著腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。EP3受體有EP3-4，EP3-5，EP3-6，EP3-7和EP3-85種剪接體亞型

2、。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞系CCLP1和HuCCT1細(xì)胞主要表達EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7四種EP3受體亞型。然而對于通過EP3受體各亞型影響膽管細(xì)胞癌的生物學(xué)行為的作用和具體機制尚不清楚。
　　β-Catenin是粘連蛋白的一種，主要介導(dǎo)細(xì)胞的粘附，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。本課題組的前期研究結(jié)果表明，PGE2通過EP3受體可以顯著地增強膽管細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力，在此工作基礎(chǔ)上，我們

3、進一步分析了EP3受體亞型在膽管細(xì)胞癌中的作用以及PGE2促進膽管細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的分子機制。
　　研究目的:
　　1.闡明EP3-4、EP3-5、EP3-6和EP3-7受體在膽管細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用。
　　2.闡明PGE2通過EP3-4受體上調(diào)β-Catenin蛋白的相關(guān)機制與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　研究內(nèi)容:
　　1.在膽管細(xì)胞癌CCLP1、HuCCT1細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中

4、，過表達轉(zhuǎn)染EP3-4， EP3-5，EP3-6和EP3-7受體亞型。
　　2.研究EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7受體亞型過表達，在促進膽管細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用。
　　3.研究PGE2通過EP3-4受體上調(diào)β-Catenin蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及相關(guān)機制。
　　研究方法:
　　1.運用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞系CCLP1、HuCCT1細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞HEK293T細(xì)胞。

5、r>　　2.應(yīng)用Real-time PCR實驗分析轉(zhuǎn)染EP3受體細(xì)胞以及其通路中相關(guān)蛋白的mRNA水平的變化。
　　3.運用Western blot實驗檢測細(xì)胞過表達轉(zhuǎn)染EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7受體亞型的轉(zhuǎn)染效率。
　　4.運用WST實驗，檢測EP3受體激動劑(sulprostone)對過表達轉(zhuǎn)染EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7受體的CCLP1、HuCCT1和HEK293T細(xì)胞增殖能力的影

6、響。
　　5.運用Transwell實驗檢測sulprostone對過表達轉(zhuǎn)染EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7受體的CCLP1、HuCCT1和HEK293T細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　6.對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一些關(guān)鍵靶點，采用化學(xué)抑制的方法，結(jié)合Western blot等實驗結(jié)果分析信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　研究結(jié)果:
　　1.在空載質(zhì)粒對照轉(zhuǎn)染、過表達轉(zhuǎn)染EP3-4、EP3-5、EP3-6和EP3-7

7、受體的CCLP1細(xì)胞系中，sulprostone上調(diào)細(xì)胞增殖能力分別至122％，145％，136％，120％和97％，上調(diào)細(xì)胞遷移能力分別至149％，224％，193％，138％，101％，上調(diào)細(xì)胞侵襲能力分別至129％，204％，193％，120％，96％。在HuCCT1和HEK293T細(xì)胞也見到類似的結(jié)果。
　　2.以空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CCLP1細(xì)胞為對照，在過表達轉(zhuǎn)染EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7受體的CCLP1

8、細(xì)胞系中，β-Catenin蛋白水平的表達分別為上升至134％，126％，102％，103％。在空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和過表達轉(zhuǎn)染EP3-4受體的CCLP1細(xì)胞中，PGE2誘導(dǎo)的β-Catenin蛋白水平上調(diào)分別為143％和193％，sulprostone誘導(dǎo)的β-Catenin蛋白水平上調(diào)分別為140％和218％。在HuCCT1細(xì)胞中也見到類似的結(jié)果。EP3受體阻斷劑L798106處理可明顯抑制PGE2誘導(dǎo)的β-Catenin蛋白水平表達。

9、r>　　3.sulprostone誘導(dǎo)過表達轉(zhuǎn)染EP3-4受體的CCLP1細(xì)胞c-Myc和Snail mRNA上調(diào)水平分別為252％和206％，誘導(dǎo)c-Myc和Snail蛋白表達水平分別上調(diào)為208％和180％。
　　4.sulprostone對過表達轉(zhuǎn)染EP3-4受體的CCLP1細(xì)胞β-Catenin mRNA水平無明顯改變，使β-Catenin磷酸化水平下降到40％。
　　5.在過表達轉(zhuǎn)染EP3-4受體的CCLP1、Hu

10、CCT1和HEK293T細(xì)胞中，sulprostone上調(diào)GSK-3β蛋白的磷酸化至343％，上調(diào)AKT蛋白的磷酸化至319％，上調(diào)EGFR蛋白的磷酸化至170％; GSK-3β抑制劑LiCl、PI3K/AKT抑制劑LY294002、EGFR抑制劑AG1478和Src抑制劑PP2不同程度的影響膽管細(xì)胞癌細(xì)胞sulprostone上調(diào)的β-Catenin蛋白水平。
　　結(jié)論:
　　1.PGE2通過EP3-4和EP3-5受體亞型