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文檔簡介
1、研究背景:
視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)將視覺信號傳入大腦,但是神經(jīng)損傷或疾?。ㄈ缜喙庋郏┛偸菚?dǎo)致神經(jīng)元的死亡和視功能的喪失。成年哺乳動物視神經(jīng)損傷后RGCs的軸突很難再生。要修復(fù)受損的視神經(jīng)必須保護神經(jīng)元的存活和促進軸突的再生。色素上皮衍生因子(PEDF)是一種具有抗血管生成、神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用的蛋白,能夠保護神經(jīng)元免受多種病理性的損害。另外它還具有抗炎能力。當視神經(jīng)損傷時晶狀體同時損傷,許多RGCs可以存活,而且其軸
2、突再生進入遠端視神經(jīng)。晶狀體損傷可以誘導(dǎo)巨噬細胞活化,巨噬細胞能夠分泌多種刺激RGCs軸突再生的細胞因子。巨噬細胞在這個過程中似乎起關(guān)鍵作用,因為單獨玻璃體注射酵母多糖而沒有晶狀體損傷,也可以誘導(dǎo)RGCs軸突再生進入遠端視神經(jīng),而酵母多糖可以刺激組織的單個核細胞。
目的:
本研究探討聯(lián)合兩種方法,即PEDF聯(lián)合巨噬細胞條件培養(yǎng)液(MCM)或晶狀體損傷是否能協(xié)同保護RGCs的存活和促進RGCs軸突的再生。
方
3、法:
1.細胞培養(yǎng):培養(yǎng)出生24h的SD仔鼠的RGC細胞以及SD大鼠腹腔巨噬細胞,觀察它們的形態(tài)、進行免疫組化鑒定,用MTT法繪制它們的生存曲線,揭示它們的培養(yǎng)規(guī)律。
2.細胞實驗:(1)巨噬細胞與酵母多糖共培養(yǎng),觀察培養(yǎng)液中血清對巨噬細胞吞噬酵母多糖顆粒的影響。(2)制備細胞爬片及MCM,觀察聯(lián)合應(yīng)用PEDF和MCM對培養(yǎng)的RGC細胞的存活數(shù)和軸突再生長度的影響。
3.動物實驗:(1)將熒光金注射到SD成
4、年大鼠及出生2w的SD幼鼠腦內(nèi),逆行性標記RGC細胞,觀察RGCs的分布規(guī)律和細胞數(shù)目。(2)制備視神經(jīng)損傷模型和晶狀體損傷模型,觀察聯(lián)合應(yīng)用玻璃體注射PEDF和晶狀體損傷對視網(wǎng)膜RGC細胞的存活數(shù)、視神經(jīng)軸突再生以及GAP-43mRNA表達的影響。
結(jié)果:
1.細胞培養(yǎng):(1)成功培養(yǎng)了SD大鼠RGC細胞,GAP-43呈陽性,培養(yǎng)第4d時,有71.4%細胞存活,而到第6d時,大量細胞開始死亡,46.3%細胞存活,第
5、8d時,只有7.1%細胞存活。(2)成功培養(yǎng)了SD大鼠腹腔巨噬細胞,CD68呈陽性,可以存活2w左右,在培養(yǎng)第8d時,約有一半細胞死亡。
2.細胞實驗:(1)巨噬細胞同酵母多糖共培養(yǎng)2d,血清組細胞數(shù)多于對照組(P<0.01)。(2)觀察對RGCs存活數(shù)目的影響:MCM組在細胞培養(yǎng)第3d時細胞數(shù)目為31.4±3.7(P<0.05),PEDF聯(lián)合MCM組為34.7±4.2(P<0.01),而對照組為27.6±2.2,與對照組均有
6、顯著統(tǒng)計學(xué)差異。PEDF聯(lián)合MCM組的細胞數(shù)大于MCM組,兩者有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。對RGC軸突再生的影響:細胞培養(yǎng)第3d時,MCM組細胞軸突長度為57.6±3.7μm,PEDF聯(lián)合MCM組的細胞軸突長度為88.6±9.5μm,與對照組(41.8±5.4μm)均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。PEDF聯(lián)合MCM組的軸突長于MCM組(P<0.01)。
3.動物實驗:(1)成功制備熒光金逆標模型,RGCs密度為221
7、9±113RGC/mm2。(2)玻璃體注射PEDF聯(lián)合晶狀體損傷可以大幅提高視神經(jīng)損傷后RGCs存活數(shù)目。與單獨應(yīng)用玻璃體注射PEDF或晶狀體損傷相比,兩者聯(lián)合可以增加RGCs總存活數(shù)(1411±84RGC/mm2),與前兩者均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。單純的晶狀體損傷能夠刺激遠端的RGCs軸突再生,PEDF聯(lián)合晶狀體損傷能夠強烈刺激遠端視神經(jīng)軸突再生,與晶狀體損傷組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。PEDF聯(lián)合晶狀體損傷在同一
8、時間點可以大幅提高視神經(jīng)損傷后GAP-43mRNA的表達,與兩者單獨進行干預(yù)均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
結(jié)論:
1.血清能夠刺激巨噬細胞的吞噬功能。
2.單獨應(yīng)用PEDF不能保護培養(yǎng)的RGC細胞存活以及促進軸突再生,MCM能保護RGC細胞存活以及促進軸突再生,與PEDF可以協(xié)同保護RGC細胞存活以及促進軸突再生。
3.玻璃體內(nèi)注射PEDF和晶狀體損傷都可以增加RGCs存活數(shù)目,兩者可以協(xié)
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