調節(jié)性T細胞移植對實驗動物腦缺血損傷的保護作用.pdf

1、目的:腦缺血損傷可誘發(fā)強大的免疫炎癥反應。免疫系統(tǒng)與缺血的腦組織之間的相互作用參與了腦中風的病理形成，因而成為了中風治療的一個新靶點。近期的研究提示CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+regulatory T cells，Tregs)作為一種自身的免疫調節(jié)細胞，其功能障礙可加重腦缺血后的腦損傷，因此可能是機體對抗腦缺血損傷后腦內炎癥反應的一種內源性的自身保護機制。然而，目前尚未有研究對外源性給予調節(jié)性T細胞靜脈移植輸注是否

2、可對腦缺血損傷起到保護作用進行過評估。故本研究擬1）明確調節(jié)性T細胞的靜脈移植輸注在嚙齒類動物腦缺血模型中的神經保護作用;2）探討潛在的細胞保護作用機制。
　　方法:免疫磁珠雙重選擇細胞提取法提取健康成年C57BL/6J小鼠及SD大鼠CD4+CD25+調節(jié)性T細胞。線栓法制備小鼠及大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型，缺血60分鐘（小鼠）或120分鐘（大鼠）后再灌注。將實驗動物隨機分為假手術對照組(Sham)、腦梗死組(MCAO)，

3、腦梗死組又分為靜脈輸注PBS組，靜脈輸注脾細胞(splenocytes，Sp)組和靜脈輸注調節(jié)性T細胞(Tregs)治療組。分別于術后24h和72h對各組動物進行神經行為學評價，并在MCAO后3天，7天及28天對腦切片進行TTC染色或MAP2免疫組化染色，計算機圖像分析系統(tǒng)測量腦梗死體積。各組動物于靜脈輸注調節(jié)性T細胞24h以及72h后經心臟取血并灌注后取腦制備腦組織冰凍切片，用免疫組織化學方法染色檢測外周免疫細胞在腦組織中的浸潤。用酶

4、聯免疫吸附法(ELISA)測定血漿基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β表達水平的變化。為進一步探討調節(jié)性T細胞所產生的神經保護作用，我們聯合采用了Gr-1抗體特異性消除中性粒細胞，MMP-9基因敲除以及骨髓嵌合子技術以及體外Treg與中性粒細胞的共培養(yǎng)技術。通過流式細胞儀分析外周免疫細胞評估Treg治療對于全身免疫功能的影響。
　　結果:在小鼠局灶性腦缺

5、血模型中，MCAO后2、6或24小時后靜脈輸注提純的調節(jié)性T細胞可減少腦缺血后的腦梗死面積約50％，對神經功能的改善可持續(xù)至MCAO后28天。MCAO后2小時給予Treg靜脈輸注治療具有最顯著的治療效果，且在大鼠腦缺血模型中也具有保護作用。值得一提的是腦缺血后Treg的有效治療窗可長達24小時。在腦缺血后1天，腦內炎癥反應、外周炎癥細胞在損傷區(qū)腦組織內的浸潤以及血腦屏障的破壞顯著減輕。
　　應用CD45.1的同類系小鼠以及細胞示蹤

6、技術，我們驚喜地發(fā)現Treg的神經保護作用并不需要其浸潤至腦組織內或抑制小膠質細胞的激活，提示其可能在外周循環(huán)中發(fā)揮保護作用。應用Gr-1抗體中和消除體內中性粒細胞，基因敲除MMP-9或將MMP-9基因敲除的骨髓轉移至野生型經照射的小鼠體內都可消除Treg的神經保護作用，顯示Treg是通過抑制外周中性粒細胞來源的基質金屬蛋白酶-9的產生，從而防止了血腦屏障的破壞。Treg與中性粒細胞共培養(yǎng)的體外實驗進一步證實了Treg是通過細胞間相互接