輔助T細(xì)胞17(Th17)與調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)在局灶性腦缺血損傷中作用及機(jī)制研究.pdf

1、圍術(shù)期腦缺血事件因其高死亡率（26％－60％）、高致殘率越來越受到人們關(guān)注，盡管人們采取了多種救治方法，但效果仍不理想，究其原因是其發(fā)病機(jī)制未得到徹底闡明。但人們注意到：在局灶性腦缺血（focalcerebralischemia，F(xiàn)CI）后一段時間里，腦損傷仍繼續(xù)進(jìn)行，并進(jìn)一步加重，該損傷系缺血腦組織增強的局部炎性反應(yīng)所致，故“炎性反應(yīng)對缺血區(qū)腦組織的損傷要比缺血本身更嚴(yán)重”。提示：炎性反應(yīng)狀態(tài)的高低與腦組織神經(jīng)功能損害程度關(guān)系密切，抑

2、制“腦缺血后炎性反應(yīng)”將成為腦缺血保護(hù)研究新的靶點。
　　近年發(fā)現(xiàn)，輔助T細(xì)胞17（Th17）與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在機(jī)體多種炎性疾病發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。因為，具有特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt的Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病及過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要促炎作用，而Th17細(xì)胞的這些作用是通過其特異性釋放細(xì)胞因子白介素17（IL-17）上調(diào)炎性因子“瀑布樣釋放”實現(xiàn)的。而特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的Treg細(xì)胞則通過直接接觸或釋放

3、抗炎細(xì)胞因子（如IL-10和TGF-β1），維持免疫耐受，對抗炎性反應(yīng)，同時，Treg細(xì)胞也可通過負(fù)性調(diào)控Thl7細(xì)胞的生成、功能及IL-17分泌發(fā)揮抗炎作用。因此，Th17與Treg細(xì)胞平衡狀態(tài)在炎性免疫相關(guān)性疾?。ㄗ陨砻庖咝约膊?、中樞炎性疾病、器官移植等）的發(fā)展與預(yù)防中起著重要作用。
　　新近研究證實：Th17細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病中起著重要作用，如多發(fā)性硬化（MS）等，此外，還發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及IL-17與缺血性腦損傷關(guān)

4、系密切?；跁簳r性或永久性腦缺血時，腦組織損傷實質(zhì)為“腦缺血后炎性反應(yīng)導(dǎo)致的局部組織損傷”的事實，且機(jī)體炎性反應(yīng)直接受免疫調(diào)控影響，故此，我們提出以下設(shè)想：
　?。?）腦缺血后可能存在Th17/Treg細(xì)胞功能失衡，該失衡與腦缺血損傷同步、關(guān)聯(lián)，此免疫調(diào)節(jié)失控進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體過度、過長的炎性反應(yīng)的存在，致使腦損傷的進(jìn)一步加重。
　　（2）通過對Th17、Treg細(xì)胞多層面免疫干預(yù)，維持Th17/Treg細(xì)胞功能平衡，可能具有抑

5、制缺血腦組織局部炎性反應(yīng)狀態(tài)及強度、減輕腦缺血后損傷的保護(hù)作用，并據(jù)此提出“腦缺血后免疫干預(yù)的腦保護(hù)預(yù)案”思路。
　　本研究系對上述第一步研究任務(wù)的完成，同時，也系2009年度國家自然科學(xué)基金面上項目資助項目（No.30872445）
　　目的：以昆明小鼠短暫性大腦中動脈栓塞模型（tMCAO）為基礎(chǔ)，擬證實小鼠腦缺血后存在Th17/Treg細(xì)胞平衡關(guān)系破壞，此失衡狀態(tài)與腦缺血后炎性損傷程度之間存在同步、相關(guān)關(guān)系，為進(jìn)一步揭示

6、腦缺血后炎性損傷機(jī)制，開拓缺血性腦損傷治療的新領(lǐng)域提供思路。
　　方法：70只昆明小鼠隨機(jī)分為模型組（n=60）和假手術(shù)組（sham，n=10），模型組又分為6h、12h、24h、48h、72h及5d六個亞組（n=10/亞組）。采用腔內(nèi)線栓法建立小鼠tMCAO模型；通過檢測腦梗死容積及神經(jīng)功能缺陷評分（NDS）觀察缺血后腦組織損傷程度；通過免疫熒光染色觀察Th17細(xì)胞在腦組織中的侵潤；并應(yīng)用流式細(xì)胞分析、ELISA、Western

7、blot分別檢測Th17及Treg細(xì)胞比率、相關(guān)細(xì)胞因子及特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3蛋白的變化。
　　結(jié)果：腦缺血再灌注后，腦組織水腫加重，梗死容積增大，48h［（44.4±3.2）％］時達(dá)峰值，而后有所減小；神經(jīng)功能學(xué)評分逐漸降低，神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)，5d（2.2±0.45）較6h（4.6±0.55）明顯提高（P＜0.05）；流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞百分率在缺血后開始逐漸增多，24h時達(dá)最大值［(0.70±0.10

8、)％，p<0.05，vsshamand5d］，而5d［(0.30±0.10)％］時又恢復(fù)至正常水平。與腦損傷程度變化一致；Treg細(xì)胞表現(xiàn)出相反變化，缺血后細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，24h［(0.9±0.29)％］時處于低谷，近乎消失，而后逐漸升高，在5d［(3.2±0.49)％，p<0.05］時恢復(fù)甚至超過正常水平；Th17及Treg相關(guān)細(xì)胞因子缺血后的變化趨勢與Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞相一致，但腦及血清中IL-17A卻表現(xiàn)出隨缺血時間延長

9、而逐漸增多的趨勢，在5d時達(dá)最大值（腦，77.9±5.11pg/ml；血清，29.44±3.06pg/ml）；Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3與Treg細(xì)胞比率變化一致，而Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt卻無明顯變化；另外，通過免疫熒光染色我們觀察到缺血壞死腦組織周邊存在Th17細(xì)胞。
　　結(jié)論：腦缺血后小鼠體內(nèi)確實存在著Th17/Treg細(xì)胞平衡關(guān)系破壞，Th17及Treg相關(guān)炎性細(xì)胞因子缺血后的變化趨勢與Th17細(xì)胞及