慶大霉素對新生大鼠耳腎組織基因表達的影響.pdf

1、目的:
　　 慶大霉素(Gentamincin,GM)為主要作用于革蘭氏陰性菌的氨基苷類抗生素,因抗菌譜廣、療效佳且費用低廉而廣泛應(yīng)用于臨床。然而,由于血清有效作用濃度與毒性作用濃度相近,其毒副作用發(fā)生率高,不宜長期大劑量使用。慶大霉素的副作用主要包括耳毒性和腎毒性,可引起不可逆的感音神經(jīng)性耳聾和急性腎功能衰竭。近年來,研究者從葡萄糖轉(zhuǎn)運障礙、Ca2+通道抑制、自由基引起的脂質(zhì)過氧化以及分子生物學(xué)等角度對上述毒副作用進行了探索,

2、但其確切機制尚未完全闡明。如何高效低毒地使用這類藥物一直是研究者關(guān)注的問題。另一方面,這類藥物也成為制備藥物性腎損傷動物模型,探索腎臟損傷及保護機制的重要工具。
　　 芯片技術(shù)是新近發(fā)展的基因表達分析平臺,具有高通量、微量化、平行化、自動化檢測等許多優(yōu)點。它以高密度的微陣列方式將大量的寡核苷酸探針或基因片段固定在某種介質(zhì)(玻片、硅片、尼龍膜等)上,從而高效檢測特定組織的基因表達情況。其理論基礎(chǔ)為核酸雜交,可以準確而高效地在全基因

3、組范圍內(nèi)同時分析樣本中成千上萬個基因的表達情況,從而有助于揭示這些基因之間的相互作用。
　　 臨床研究提示,兒童期服用慶大霉素更容易引起耳腎損害,這可能與這一時期二者尚未發(fā)育成熟有關(guān)。既往研究慶大霉素引起的耳腎損害多以成年大鼠為對象,針對耳腎發(fā)育關(guān)鍵期的研究則較少。大鼠出生后第4～14天是腎臟和耳蝸迅速發(fā)育的階段,而肝臟則是藥物代謝的重要器官。因此,本研究以新生期大鼠為研究對象,采用含有31,000個探針組,28,000個基因的

4、Affymetrix2302.0大鼠全基因組芯片,從而獲得給藥組和對照組新生大鼠發(fā)育關(guān)鍵時期上述三種組織的基因差異表達譜,并進行比較分析,初步探討三者在發(fā)育過程中基因表達的變化,為慶大霉素引起的耳腎毒性損害提供線索。
　　 材料與方法:
　　 1、實驗材料:健康新生Wistar大鼠30只;慶大霉素;血清肌酐、血尿素氮檢測試劑盒;RNA抽提相關(guān)試劑;PCR相關(guān)試劑以及基因表達譜芯片相關(guān)試劑等。
　　 2、實驗方法:

5、出生后4天大鼠30只,隨機分為2組,包括給藥組和對照組,每組15只,給藥組每天下午13:00肌肉注射慶大霉素80mg/kg,連續(xù)注射7天,對照組每天注射等體積生理鹽水,注射7天后每組15個樣本取全血,各組隨機抽取5個樣本取耳蝸、腎、肝組織。將每組的同種組織混合,全血用于檢測腎功能指標(biāo)血肌酐,血尿素氮水平。耳蝸、腎臟、肝臟組織分別送基因表達譜芯片檢測。
　　 3、生物信息學(xué)分析:確定存在表達差異的基因名單,借助DAVID數(shù)據(jù)庫(h

6、ttp://David.abcc.neifcrf.gov/)對差異基因集合進行GO注釋描述,根據(jù)功能注釋和Pathway分析獲取差異基因可能參與的代表性通路。
　　 結(jié)果:
　　 1、肌注慶大霉素組大鼠血肌酐、血尿素氮水平較對照組顯著提高(P＜0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義:
　　 2、各組樣本均得到28s和18s兩個明顯條帶的總RNA,后者在OD260/OD280吸光度值均在1.8～2.0之間,提示其純度和完整

7、性較好;
　　 3、獲得了慶大霉素誘導(dǎo)的給藥組和對照組新生大鼠的基因表達差異譜;
　　 4、給藥組與對照組相比,在耳蝸組織中共檢出250個存在顯著表達差異的基因,其中140個表達上調(diào),110個表達下調(diào)。在腎臟組織中共檢出466個存在顯著表達差異的基因,其中398個表達上調(diào),68個表達下調(diào)。在肝臟組織中共檢出472條顯著表達差異的基因,其中280個表達上調(diào),192個表達下調(diào);
　　 5、應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO

8、分析,耳蝸組織差異基因主要參與的通路有凋亡信號通路、T細胞活化通路、炎癥介導(dǎo)的趨化因子和細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、p53通路的反饋回路等。腎臟組織差異基因主要參與的通路有趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞因子與受體相互作用、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒作用、B細胞受體信號通路、RIG-1樣受體信號通路、Wnt信號通路、細胞粘附、細胞周期、p53信號通路、T細胞受體信號通路等。
　　 6、三組交叉比較:在耳、腎中表達變化相似,

9、而肝臟中無變化的基因有21個,其中已知基因14個、未知基因7個。探針號為1372011_at的基因在耳蝸、腎臟中均參與嘌呤代謝途徑;探針號為1379365_at的基因在腎臟中參與趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞因子與受體相互作用等;探針號為1385439_x_at的基因在腎臟中參與RIG-I樣受體信號通路。
　　 結(jié)論:
　　 1、慶大霉素可顯著影響新生大鼠的。腎功能指標(biāo),導(dǎo)致腎損傷;
　　 2、慶

10、大霉素對新生期大鼠的毒性作用涉及許多基因的表達變化,這些基因可能參與調(diào)控相關(guān)組織的功能、發(fā)育和成熟;
　　 3、采用全基因表達譜芯片篩選出一系列存在差異表達的基因,其中重要的候選基因包括1372011_at(GeneSymbol未知)、1379365_at(GeneSymbol:Cxel11)、1385439_x_at(GeneSymbol:Dhx58),可能參與嘌呤代謝、趨化因子信號通路、RIG-I樣受體信號通路等,這些可能為