蘿卜RsMYB28和RsMYB29轉(zhuǎn)錄因子基因克隆與表達特征分析.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus L.)是一種重要的十字花科根菜類作物，具有較高的營養(yǎng)價值，在中國乃至世界都有廣泛種植。硫代葡萄糖苷是一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于蘿卜等十字花科植物中。硫苷及其降解產(chǎn)物在植物防御、風味形成以及人類癌癥預防中起重要的作用，此外，它還具有作為生物農(nóng)藥的潛力。MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB28、MYB29、MYB76等是硫苷生物合成過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因，其表達量的多少直接影響蘿卜中硫苷的含量和分布。調(diào)控基

2、因的某些特性在擬南芥、花椰菜、芥菜、小白菜、大白菜等十字花科作物已有廣泛研究，然而在蘿卜研究領(lǐng)域關(guān)于MYB28和MYB29的分子特性、表達特征尚未見報道。因此，本論文以蘿卜品種‘NAU-ZQH’為材料，通過比對擬南芥中MYB28和MYB29的序列與本實驗室蘿卜轉(zhuǎn)錄組序列，克隆蘿卜中調(diào)控硫苷合成的兩個關(guān)鍵基因RsMYB28和RsMYB29，之后從亞細胞定位、轉(zhuǎn)錄激活活性和表達特征等多方面進行研究，以期，增加對蘿卜中RsMYB28和RsMY

3、B29基因分子特性和表達特征的認識，為后期通過基因改良培育出硫苷含量較高的蘿卜新品種提供理論基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.通過比對，對擬南芥中MYB28和MYB29的序列以及參照本實驗室蘿卜轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計出兩對特異引物RsMYB28F1/R1和RsMYB29F1/R1，從蘿卜中分離得到RsMYB28和RsMYB29的DNA和cDNA全長。其中RsMYB28基因組DNA和cDNA全長分別為1836 bp和1614 bp，包括1

4、092 bp的開放閱讀框(ORE)，編碼363個氨基酸。RsMYB29基因組DNA全長1493 bp，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，cDNA全長1093 bp，包括1023bp的開放閱讀框(ORF)，編碼340個氨基酸。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)顯示兩個基因都含有典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。序列比對及進化樹分析表明，RsMYB28和RsMYB29都與芥菜和甘藍在同一分支上，且與白菜和擬南芥具有較高同源性。同時利用染色體步移法克隆這兩個MYB基因的啟動子序

5、列，得到的RsMYB28基因5'側(cè)翼序列1257 bp，RsMYB29基因5'側(cè)翼序列576 bp。啟動子元件分析顯示，RsMYB28和RsMYB29基因啟動子序列包含多個光應答相關(guān)元件，此外RsMYB28基因啟動子還具有乙烯、赤霉素、干旱、抵御和脅迫響應相關(guān)的逆境脅迫響應元件，RsMYB29基因啟動子還含有干旱、水楊酸生物鐘等響應元件。
　　2.利用qRT-PCR技術(shù)對兩個基因進行表達分析顯示，RsMYB28和RsMYB29基因

6、的轉(zhuǎn)錄表達水平在種子和膨大前期表達量最高，膨大盛期表達量最小，RsMYB28基因表達量較大的部位為莖和葉片。RsMYB29基因除了膨大盛期，表達量較大的部位為根和葉片。不同處理下的表達特性分析顯示，創(chuàng)傷、葡萄糖和ABA處理促進RsMYB28基因的表達，RsMYB29基因的在創(chuàng)傷、MeJA和葡萄糖處理后表達量增加。同時構(gòu)建了過表達載體pCAMBIA1301-RsMYB28和pCAMBIA1301-RsMYB29，并成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

7、　　3.構(gòu)建載體pGBKT7-RsMYB28和pGBKT7-RsMYB29，轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2H，接種于SD/-Trp培養(yǎng)基培養(yǎng)。最后分別接種于SD/-His-Ade和SD/X-α-gal培養(yǎng)基中觀察酵母生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有pGBKT7-RsMYB28和pGBKT7-RsMYB29質(zhì)粒的菌株能正常生長并在SD/ X-α-gal培養(yǎng)基中顯示藍色，說明RsMYB28和RsMYB29在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性。構(gòu)建綠色熒光蛋白融合載體，通過基