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文檔簡介
1、研究背景:
膀胱癌是人類的多發(fā)病和常見病,全世界范圍內(nèi)膀胱癌發(fā)病率有逐年增加的趨勢。流行病學(xué)的研究提示膀胱癌的發(fā)生受到很多環(huán)境因素的影響,其中就包括通過飲用咖啡等途徑對咖啡因的攝入,過量攝入咖啡因可增加發(fā)生膀胱癌的危險性。但咖啡因又是世界范圍內(nèi)消耗最大、應(yīng)用最廣泛的一種神經(jīng)刺激物,由于人口基數(shù)很大,如果咖啡因確實能引起膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展,那么對整個人群健康就會產(chǎn)生重大的影響。因此,對咖啡因與膀胱癌之間究竟是何關(guān)系及可能的影
2、響機(jī)制進(jìn)行深入的研究就顯得十分的必要。
第一部分研究咖啡因(caffeine)對p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響
研究目的:
應(yīng)用MTT及流式細(xì)胞技術(shù),觀察咖啡因(caffeine)、離子射線(IR)和兩者聯(lián)合應(yīng)用對p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生的反應(yīng),以了解咖啡因?qū)Π螂装┘?xì)胞凋亡的影響。
材料和方法:
1.RT4膀胱癌細(xì)胞的培養(yǎng)。
2.細(xì)胞分組
3、及處理。
3.單純IR對RT4膀胱癌細(xì)胞增殖活性的影響(MTT法)。
4.IR聯(lián)合咖啡因?qū)T4膀胱癌細(xì)胞增殖活性的影響(MTT法)。
5.流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡。
6.統(tǒng)計學(xué)分析。
結(jié)果:
1.IR促進(jìn)了體外培養(yǎng)的RT4膀胱癌細(xì)胞株的凋亡。
2.咖啡因能降低IR對RT4膀胱癌細(xì)胞的殺傷作用。
結(jié)論:
1.I
4、R照射RT4膀胱癌細(xì)胞后,細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡,并具有時間和劑量依賴模式。
2.IR和咖啡因共同處理后,細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡,也并具有時間和劑量依賴模式。
3.加入濃度為1mM的咖啡因后,受不同放射劑量作用的RT4膀胱癌細(xì)胞的凋亡數(shù)量均有明顯的下降,表明1mM濃度的咖啡因?qū)T4膀胱癌細(xì)胞株有放射保護(hù)作用。
第二部分研究咖啡因(caffeine)對p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞周期的影響
研究目的:
5、
通過對咖啡因(caffeine)、離子射線(IR)和兩者聯(lián)合處理過的p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測,以了解咖啡因?qū)53(+)的RT4膀胱癌細(xì)胞周期的影響。
材料和方法:
流式細(xì)胞技術(shù)檢測各個細(xì)胞周期的細(xì)胞。
結(jié)果:
1.IR照射可引起G0/G1和G2/M細(xì)胞期的阻滯,其中以G2/M期阻滯更加明顯。
2.1mM咖啡因也可引起細(xì)胞周期G0/
6、G1和G2/M的阻滯,也對G2/M的阻滯更加明顯。
3.咖啡因降低了IR對膀胱癌RT4細(xì)胞周期阻滯的影響,使細(xì)胞快速通過G0/G1,卻在G2/M期的阻滯增加。
結(jié)論:
RT4膀胱癌細(xì)胞受照射后發(fā)生G0/G1和G2/M細(xì)胞周期阻滯的出現(xiàn)和消退與放射敏感性可能有一定的關(guān)系,咖啡因通過增加RT4細(xì)胞在G2/M期的阻滯,降低了RT4細(xì)胞的凋亡,呈現(xiàn)出放射保護(hù)作用。
第三部分探討咖啡因(ca
7、ffeine)影響p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞的DNA損傷反應(yīng)機(jī)制
研究目的:
檢測經(jīng)咖啡因(caffeine)、離子射線(IR)和兩者聯(lián)合處理過的p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞的γH2AX,ATM,ATR,pATM,Chk1,Chk2,p-Chk2,p53,p-p53,p21,PUMA,F(xiàn)AS等一系列DNA損傷反應(yīng)物質(zhì),來探討咖啡因?qū)T4膀胱癌細(xì)胞影響的可能機(jī)制。
材料和方法:
8、1.免疫熒光法檢測γH2AXfoci的數(shù)量和密度。
2.RealtimePCR檢測p53及其靶基因的表達(dá)。
3.Westernblotting檢測p53,p-p53,ATM,p-ATM,ATR,Chk2,p-Chk2,γH2AX,PUMA,p21和CaSpase-3等的表達(dá)。
結(jié)果:
1.咖啡因通過抑制上游調(diào)節(jié)物來抑制γH2AX。
2.咖啡因抑制了p53以及其靶基因的
9、表達(dá)。
3.咖啡因降低了IR對RT4膀胱癌細(xì)胞的凋亡。
結(jié)論:
1.IR可能通過ATM-Chk2-p53-Puma信號軸對RT4細(xì)胞起到殺傷作用。
2.咖啡因通過抑制ATM和ATR等DNA損傷-反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)等上游調(diào)節(jié)物來抑制γH2AX的表達(dá)。
3.咖啡因抑制了TP53,p21,PUMA,F(xiàn)AS等p53下游靶基因的表達(dá)。
4.啡因可能通過抑制RT4膀胱癌細(xì)胞的
10、DNA損傷反應(yīng)信號通路來降低IR對它的殺傷作用,咖啡因?qū)T4膀胱癌細(xì)胞起到了放射保護(hù)的作用。
第四部分咖啡因(caffeine)對RT4膀胱癌在裸鼠體內(nèi)影響的研究
研究目的:
利用體外培養(yǎng)的RT4膀胱癌細(xì)胞株接種裸鼠,制造出荷瘤的裸鼠動物模型,然后用離子射線(IR)來照射用咖啡因處理過的實體瘤,來驗證咖啡因是否會增加RT4膀胱癌細(xì)胞的放射敏感性及其可能的機(jī)制。
材料和方法:
11、> 1.RT4膀胱癌細(xì)胞的培養(yǎng)。
2.RT4膀胱癌細(xì)胞的復(fù)蘇和凍存。
3.建立RT4膀胱癌細(xì)胞株的裸鼠模型。
4.實驗分組及處理。
5.免疫組化分析檢測γH2AX和p-ATM的表達(dá)。
結(jié)果:
1.RT4膀胱癌細(xì)胞株荷瘤裸鼠動物模型的成功建立。
2.咖啡因降低了正常裸鼠膀胱粘膜細(xì)胞在IR后的凋亡。
3.咖啡因降低RT4膀胱
12、癌細(xì)胞對IR的敏感性,減少了IR后γH2AX形成。
4.咖啡因降低了IR對RT4膀胱癌細(xì)胞的影響,降低了IR后pATM的表達(dá)。
結(jié)論:
1.用培養(yǎng)的RT4膀胱癌細(xì)胞株能建立良好的荷瘤裸鼠動物模型。
2.1mM濃度的咖啡因能降低IR引起的膀胱癌細(xì)胞株實體瘤的凋亡。
3.1mM濃度咖啡因可能通過抑制了ATM-Chk2-P53-Puma的途徑以及激活了其他DNA損傷反應(yīng)途徑
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