Tollip過(guò)表達(dá)對(duì)百草枯中毒所致急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　百草枯(paraquat,PQ)中毒所致急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是PQ中毒死亡的主要原因，主要表現(xiàn)為急性肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化。由于中毒機(jī)制目前尚未闡明，而且沒(méi)有特效的治療手段，絕大多數(shù)病例死亡。因此，研究PQ中毒機(jī)制及其治療手段，具有非常重要的科學(xué)意義和社會(huì)應(yīng)用前景。
　　一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果得到的公認(rèn)結(jié)論是氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)起著重要的作用。由于Toll樣受體（Toll-lik

2、e receptors，TLRs）位于炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最上游環(huán)節(jié)，因而被認(rèn)為是進(jìn)行炎癥反應(yīng)調(diào)控治療的潛在理想靶點(diǎn)。TLRs近年來(lái)在機(jī)體對(duì)外來(lái)病原體的識(shí)別和啟動(dòng)天然防御系統(tǒng)方面的研究有很重要的進(jìn)展，在調(diào)節(jié)ALI后的炎癥和修復(fù)機(jī)制方面扮演著重要的角色，而越來(lái)越多的證據(jù)表明TLRs在非感染性肺疾病中也扮演重要的角色。在動(dòng)物模型中，大量的數(shù)據(jù)說(shuō)明，TLR2和4對(duì)于非感染性刺激而促發(fā)炎癥反應(yīng)。
　　Toll作用蛋白(Toll-interact

3、ing protein，Tollip)是新近發(fā)現(xiàn)的一種接頭蛋白，是TLRs/IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)重要的負(fù)性調(diào)控因子，而該通路與炎癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，它可以抑制IRAK的磷酸化，從而阻止下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，在炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。大量研究結(jié)果已證實(shí)Tollip過(guò)表達(dá)可以抑制TLR2和TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，限制促炎介質(zhì)的生成，從而起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。因此，上調(diào)Tollip表達(dá)在治療急性炎癥性

4、疾病中可能是一種有效的治療策略。
　　本研究擬通過(guò)構(gòu)建攜帶小鼠源性Tollip基因重組腺病毒載體上調(diào)Tollip的表達(dá)。通過(guò)觀察A549細(xì)胞在基因表達(dá)、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等方面的變化，研究Tollip過(guò)表達(dá)對(duì)百草枯誘導(dǎo)的A549細(xì)胞功能的影響;并在動(dòng)物水平上，確定Tollip對(duì)PQ中毒所致小鼠ALI的保護(hù)作用，為PQ所致ALI的防治提供新的作用靶點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、小鼠Tollip基因重組腺病毒載體的表達(dá)與驗(yàn)

5、證
　　通過(guò)Ad.mTollip感染A549細(xì)胞和小鼠肺組織，建立Ad.mTollip體內(nèi)外的感染模型，利用Western-blot、免疫組化和肺組織切片HE染色的方法，對(duì)Ad.mTollip在真核細(xì)胞與肺內(nèi)的表達(dá)效力及對(duì)宿主肺部病理改變的影響進(jìn)行檢測(cè)。
　　2、Tollip過(guò)表達(dá)對(duì)百草枯誘導(dǎo)的A549細(xì)胞功能的影響及機(jī)制研究
　　通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率篩選出PQ濃度及作用時(shí)間，以MOI=100分別加入Ad.m

6、Tollip或Ad.V感染A549細(xì)胞，48h后以PQ600μmol/L處理細(xì)胞，作用時(shí)間點(diǎn)為24h，分四組:control組、PQ組、PQ+Ad.V組、PQ+Ad.mTollip組。用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、RT-PCR和Western-blot的方法觀察TLR2、TLR4和Tollip在A549細(xì)胞中的表達(dá)情況;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量;檢測(cè)超氧化物歧化酶的活性和丙二醛的含量;用EMSA檢測(cè)A549細(xì)胞中NF-κB核轉(zhuǎn)錄水平的變化

7、;用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-1β水平變化。
　　3、Tollip過(guò)表達(dá)對(duì)百草枯中毒所致小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用
　　選擇清潔級(jí)C57BL/6J小鼠42只，8-12周齡，體重20-25 g，雌雄不限，隨機(jī)分為七組:control、PQ24h組、PQ72h組、PQ+Ad.V24h組、PQ+Ad.V72h組、PQ+Ad.mTollip24h組、PQ+Ad.mTollip72h組，每組6只小鼠。用氣管內(nèi)滴注的方法，以5×108

8、PFU/只的劑量建立小鼠Ad.mTollip感染模型，同時(shí)空病毒載體Ad.V作為對(duì)照。感染48h后，腹腔注射PQ28 mg/kg建立急性肺損傷模型。在PQ染毒后24h、72h，用免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR和Western-blot的方法觀察Tollip在小鼠肺內(nèi)的表達(dá)情況;HE染色觀察小鼠肺組織病理學(xué)變化并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分;檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶的活力;用EMSA檢測(cè)肺內(nèi)NF-κB核轉(zhuǎn)錄水平的變化;用ELISA檢測(cè)血清和肺組織勻漿中IL-1

9、β水平變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、通過(guò)Western-blot和免疫組化方法分別檢測(cè)到重組腺病毒Ad.mTollip可以有效地在A549細(xì)胞內(nèi)和小鼠肺內(nèi)穩(wěn)定表達(dá);且經(jīng)氣管內(nèi)滴注感染宿主后，不會(huì)引起宿主肺組織發(fā)生病理變化。
　　2、通過(guò)CCK-8法確定PQ600μmol/L作用24h作為實(shí)驗(yàn)的干預(yù)點(diǎn);通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、Real-time PCR和Western-blot方法觀察在PQ誘導(dǎo)后，TLR2和TLR4在mRN

10、A水平和蛋白水平都有顯著升高(P＜0.05)，而Tollip在mRNA水平和蛋白水平都有所下降，轉(zhuǎn)染Ad.mTollip后，TLR2和4表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，而Tollip的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05);與PQ組和PQ+Ad.V組相比，PQ+Ad.mTollip組ROS水平和MDA含量均明顯降低，而SOD水平均明顯升高(P＜0.05);細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性明顯降低，炎癥因子IL-1β的生成隨之明顯降低(P＜0.05)。
　

11、　3、免疫組化、RT-PCR以及Western-blot的方法觀察Tollip在PQ組和PQ+Ad.V組表達(dá)減弱，表達(dá)強(qiáng)度低于正常對(duì)照組，而與PQ組和PQ+Ad.V組相比，PQ+Ad.mTollip組的Tollip表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P＜0.05);轉(zhuǎn)染Ad.mTollip后，與PQ組和PQ+Ad.V組相比，PQ+Ad.mTollip組小鼠肺組織的損傷減輕、肺內(nèi)MPO和NF-κB的活性降低、血清和肺組織勻漿中炎癥介質(zhì)IL-1β的含量減少。

12、
　　結(jié)論：
　　1、重組腺病毒Ad.mTollip可以有效地在A549細(xì)胞內(nèi)和小鼠肺內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)對(duì)于宿主而言也是安全可行的。
　　2、TLR2和TLR4可能參與了PQ導(dǎo)致A549細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。
　　3、轉(zhuǎn)染Ad.mTollip后，Tollip過(guò)表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量均明顯降低，而SOD水平明顯升高，抑制PQ導(dǎo)致A549細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。
　　4、PQ導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)可能是