腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子CD82-CD9和c-Met介導(dǎo)的信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移中作用的研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）是由間質(zhì)細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）產(chǎn)生的多肽類細(xì)胞因子，又稱間充質(zhì)因子。HGF具有許多重要的生物學(xué)功能，如促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分裂；抑制細(xì)胞間隙連接的生成和細(xì)胞之間的粘附，導(dǎo)致細(xì)胞的離散；上調(diào)尿激酶型纖溶酶原激活物及受體（uPA/uPAR）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解；增加細(xì)胞骨架蛋白磷酸化，破壞細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞易于變形和遷移。因此，HGF又稱促有絲分裂因

2、子、離散因子、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生素或促遷移因子。HGF在胚胎的發(fā)育、器官的形成、細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，也與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、浸潤(rùn)、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移有著非常密切的關(guān)系。 HGF的受體（hepatocyte growth factor receptor，HGFR）是原癌基因c-met編碼的產(chǎn)物，又稱c-Met。c-Met屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族成員，常由上皮細(xì)胞（如肝、腎、消化道細(xì)胞）表達(dá)。c-Met在腫瘤細(xì)胞表達(dá)增加，

3、并與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。HGF由間質(zhì)細(xì)胞分泌后，經(jīng)旁分泌途徑作用于周圍靶細(xì)胞。HGF與受體c-Met結(jié)合后，導(dǎo)致受體二聚化和活化，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。已知HGF/c-Met活化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)起碼有三條，包括有絲分裂原激活的蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（MAPK信號(hào)通路）、磷脂酶Cγ1/二脂酰甘油/蛋白激酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（PLCγ1/DAG/PKC信號(hào)通路）和三磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（P13K/PKB信號(hào)

4、通路）。其中，PI3K/PKB和PLCγ/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要途徑。 KAI-1/CD82和MRP-1/CD9均屬于4跨膜蛋白基因家族編碼的產(chǎn)物。CD82是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因KAI-1編碼的產(chǎn)物，目前被認(rèn)為是廣譜的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子。CD9又稱細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白-1（motility-related protein-1）。二者均可下調(diào)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。對(duì)其作用機(jī)制研究表明，CD8

5、2和CD9通過(guò)與c-Met相互作用，抑制HGF誘導(dǎo)的c-Met酪氨酸蛋白激酶的活化，或抑制c-Met與整合素（integrins）的相互作用，下調(diào)c-Met對(duì)PI3K/PKB和PLCγ/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化，從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)移抑制作用。 Hca-F細(xì)胞株和HCa-P細(xì)胞株為同一來(lái)源但具有不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力的兩個(gè)細(xì)胞株。Hca-F為高淋巴道轉(zhuǎn)移株，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為80%，Hca-P為低淋巴道轉(zhuǎn)移株，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為0-20%。兩細(xì)胞

6、株淋巴道轉(zhuǎn)移能力差別產(chǎn)生的分子機(jī)制尚不十分清楚。本課題主要比較兩細(xì)胞株CD82/CD9和c-Met的表達(dá)以及PI3K/PKB和PLCγ1/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性變化，以探討腫瘤細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。 方法：小鼠腹水型肝癌Hca-F和Hca-P細(xì)胞株于小鼠腹腔培養(yǎng)。分別收集細(xì)胞后，分離提取細(xì)胞總蛋白，制備胞漿蛋白和顆粒結(jié)合蛋白。采用SDS-PAGE、Western Blotting技術(shù)及計(jì)算機(jī)掃描定量分析兩細(xì)胞株CD82/C

7、D9的表達(dá)和PI3K/PKB和PLCγ1/PKC信號(hào)通路的活性。 結(jié)果：1）CD82/CD9的表達(dá)：CD82在高淋巴道轉(zhuǎn)移株Hca-F細(xì)胞和低淋巴道轉(zhuǎn)移株Hca-P細(xì)胞中的表達(dá)沒(méi)有顯著性差別，Hca-P細(xì)胞CD9表達(dá)顯著高于Hca-F細(xì)胞（Hca-P是Hca-F的1.31倍，P=0.4%，n=3），提示CD9可能是影響兩細(xì)胞株淋巴道轉(zhuǎn)移能力的主要因素。2）PI3K/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：采用Western Blotting技術(shù)對(duì)兩

8、細(xì)胞株P(guān)DK的表達(dá)和在細(xì)胞中的分布以及PKB磷酸化活化進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，兩細(xì)胞株磷酸化PKB的表達(dá)無(wú)顯著性差別；PDK在兩細(xì)胞株的分布也無(wú)顯著差異；說(shuō)明PI3K/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不是影響兩細(xì)胞株淋巴道轉(zhuǎn)移能力主要途徑。3）PLCγ1/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：采用Western Blotting技術(shù)對(duì)兩細(xì)胞株P(guān)LCγ1及不同亞型PKCs的活性進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，淋巴道低轉(zhuǎn)移株Hca-P細(xì)胞磷酸化的PLCγ1表達(dá)明顯低于淋巴道高

9、轉(zhuǎn)移株Hca-F細(xì)胞（Hca-P是Hca-F的45.23%倍，P<0.05，n=3）；Hca-P細(xì)胞中膜結(jié)合的PKCα、PKCβ1和PKCβ2含量明顯低于Hca-F細(xì)胞（Hca-P細(xì)胞PKCα、PKCβ1和PKCβ2分別是Hca-F細(xì)胞的71.75%、76.80%和73.16%，P<0.05，n=3）。說(shuō)明高轉(zhuǎn)移株Hca-F細(xì)胞的PLCγ1/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性高于低轉(zhuǎn)移株Hca-P細(xì)胞。PLCγ1/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是影響兩細(xì)