食品中百草枯殘留免疫學(xué)分析方法的研究與應(yīng)用.pdf

1、百草枯(pamquat，PQ)是一種廣譜、滅生性有機(jī)雜環(huán)類除草劑。由于百草枯的廣泛應(yīng)用，造成食品原料和水體污染，對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在危害。目前百草枯檢測(cè)方法大多需要專門的儀器設(shè)備并且操作繁瑣，已無法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。因此，研究和建立一種方便、安全和快速的檢測(cè)方法具有重要意義。本文以多克隆抗體和膠體金合成標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)，建立了百草枯的酶聯(lián)免疫(ELISA)和金標(biāo)免疫層析(GICA)檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于食品中的檢測(cè)。 首先以4

2、,4'-聯(lián)吡啶和碘甲烷為起始原料，經(jīng)三步反應(yīng)合成了百草枯半抗原N—甲基—N’—戊酸基一二吡啶二溴化物，經(jīng)LC/MS、1HNMR和IR鑒定結(jié)果表明，所得產(chǎn)物即為百草枯半抗原(簡(jiǎn)稱PQ—h)，其純度為96％，得率為69％。通過混合酸酐法偶聯(lián)大分子蛋白載體牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)制備免疫抗原(PQ—h—BSA)和包被抗原(PQ—h—OVA)，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。利用分光光度法測(cè)定百草枯半抗原與BSA的偶聯(lián)比為6：1。 通

3、過免疫新西蘭大白兔，獲得特異性多克隆抗體，效價(jià)為51200。建立了PQ檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，經(jīng)過多次棋盤試驗(yàn)，最終確立最適包被抗原濃度為0.3μg/mL，抗體最佳稀釋度為1:5000。該方法的半數(shù)抑制率IC50為5.13ng/mL，最低檢出限為0.005ng/mL。百草枯與敵草快的交叉反應(yīng)率小于0.1％。大豆樣品的加標(biāo)回收率在70％～80％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于10％。 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，通過研究

4、膠體金與抗體蛋白作用過程，確定穩(wěn)定標(biāo)記1ml膠體金需8.1μg抗體蛋白，標(biāo)記體系的最佳pH為8.5。以金標(biāo)抗體作為分析探針，PQ—h—OVA作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，以羊抗兔IgG為控制抗體，構(gòu)建直接競(jìng)爭(zhēng)膠體金標(biāo)免疫層析檢測(cè)體系。確定膜上包被抗原和羊抗兔二抗的最佳包被濃度分別為0.5mg/ml和0.11mg/ml。金標(biāo)目測(cè)檢出限為10ng/ml，檢測(cè)時(shí)間約5min。方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，經(jīng)推測(cè)，該試紙條在室溫下至少可以保存5個(gè)月。對(duì)大豆進(jìn)行加標(biāo)