Cx26-Cx32組成的細胞縫隙連接對順鉑細胞毒性的影響.pdf

1、研究背景： 順鉑(cisplatin，CDDP)是臨床常用的抗腫瘤藥，屬細胞周期非特異性藥物。它通過被動轉(zhuǎn)運以非電荷形式通過細胞膜，進入細胞后氯離子被水分子取代，呈陽性電荷，然后與DNA上的堿基結(jié)合，形成鏈間和鏈內(nèi)交聯(lián)，破壞DNA的功能。如果這種損傷未能修復(fù)，將導(dǎo)致細胞生長停滯在G2期并出現(xiàn)凋亡及死亡。 順鉑對睪丸癌、卵巢癌、肺癌和頭頸部癌等實體瘤都有很好的療效，是多種腫瘤化療方案中的組成藥物。但是，腫瘤對順鉑產(chǎn)生耐藥性

2、(內(nèi)在性或獲得性)，影響了順鉑的臨床療效；至今為止，順鉑耐藥性產(chǎn)生的機理仍未闡明。闡明腫瘤對順鉑產(chǎn)生耐藥性的機理，對于減少耐藥、提高順鉑的療效、擴大順鉑臨床應(yīng)用范圍具有重要的指導(dǎo)意義。 細胞縫隙連接(gapjunction，GJ)是細胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道，廣泛存在于實質(zhì)性臟器(如心臟，肝臟，腎臟，中樞神經(jīng)，皮膚，肌肉等)組織中。GJ提供了一種細胞與細胞之間的直接聯(lián)系通道，是細胞之間信號傳遞的一種重要方式。GJ異常與許多疾病

3、(包括腫瘤)的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。在多數(shù)腫瘤的形成過程中，常伴隨GJ功能降低或消失?；謴?fù)腫瘤細胞的GJ，可抑制腫瘤細胞的生長、分化，有利于重建正常的細胞生長調(diào)控機制。因此，GJ是一種公認的腫瘤抑制因素。最近的研究證明：在培養(yǎng)的正常細胞和腫瘤細胞，GJ能夠增強多種化學(xué)毒物引起細胞凋亡的作用。我們和其它研究發(fā)現(xiàn)：順鉑的細胞毒性在GJ存在的情況下顯著增強。 GJ影響順鉑等抗腫瘤藥物細胞毒性的機理不明。順鉑等抗腫瘤藥物的細胞毒性在有

4、GJ存在的情況下增強這一事實表明，順鉑等在引起細胞凋亡(或壞死)的同時，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生了某種可以通過GJ傳遞的“死亡信號”；這種“死亡信號”通過GJ傳遞到毗鄰的細胞，引起其它細胞死亡或加強順鉑的細胞毒性，這種現(xiàn)象稱為“旁細胞效應(yīng)”。我們推測，當(dāng)GJ功能降低時，順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的“死亡信號”不能通過GJ擴散到毗鄰的細胞；這種“旁細胞效應(yīng)”減弱或消失將會導(dǎo)致順鉑的細胞毒性降低。根據(jù)此推測和腫瘤組織常伴有GJ功能降低或消失的事實，我們假設(shè)：腫瘤細胞

5、GJ功能減退導(dǎo)致順鉑細胞毒性降低，這可能是順鉑耐藥性產(chǎn)生的機理之一。 為了證明這一假設(shè)，本研究擬在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx26/Cx32的HeLa細胞上，用多種方法改變GJ功能，通過觀察GJ功能改變對順鉑細胞毒性的影響，深入探討GJ與順鉑細胞毒性的關(guān)系。 研究方法： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx26/Cx32的HeLA細胞，用“標準細胞集落形成分析法”(standardcolony-formingassay)和SRB(sulf

6、orhodamineB)法測定順鉑對細胞生長的抑制作用(細胞毒性)。 用不同密度接種細胞的方法，獲得生長融合細胞(有條件形成GJ)與生長未融合細胞(無形成GJ的條件)。在上述不同密度接種的細胞，觀察GJ形成對順鉑的細胞毒性影響。 用“細胞接種熒光示蹤法”(ParachuteAssay)測定培養(yǎng)細胞間的GJ功能；并觀察目前常用的能影響GJ藥物oleamide，18-α-GA和RA對由Cx26/Cx32組成的GJ功能的影響。

7、 用doxycycline控制Cormexin表達，以及用上述藥物改變GJ功能對順鉑細胞毒性的影響。 實驗結(jié)果： 1、不同細胞生長密度對順鉑細胞毒性的影響 細胞集落形成實驗結(jié)果顯示：在生長融合和生長未融合的細胞，5μM順鉑作用1小時后，都能夠顯著地降低細胞集落形成率。在生長融合細胞(細胞之間形成緊密接觸，有條件形成GJ)，順鉑對細胞集落生長的抑制率明顯高于生長未融合細胞(細胞之間未形成接觸，無形成GJ的條

8、件)。SRB結(jié)果顯示，在1×103～4×104/ml的范圍內(nèi)，隨著細胞密度的增加，5μM順鉑作用24小時后順鉑細胞毒性逐漸增強。結(jié)果表明，細胞密度增加可顯著增強順鉑的細胞毒性。 2、改變Connexin表達對順鉑細胞毒性的影響 細胞接種熒光示蹤實驗顯示，在一定范圍內(nèi)(0.01-1μg/ml)，隨著doxycycline濃度的增加，細胞通過GJ的熒光傳遞功能逐漸增強。結(jié)果證明，增加doxycycline的濃度，不僅可以增加

9、Cx的表達，而且能夠增加GJ形成和功能。集落形成實驗結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)(0.01—1μg/ml)，隨著doxycycline濃度的升高，順鉑對細胞集落形成的抑制率逐漸增加。結(jié)果證明，順鉑的細胞毒性隨GJ功能的增強而增大。 3、抑制GJ功能對順鉑細胞毒性的影響 Oleamide和α-GA是常用的GJ抑制劑，但未見有對由Cx26/Cx32組成的GJ功能影響的報道。細胞接種熒光示蹤實驗顯示，與對照組相比，25μMoleam

10、ide組和10μMα-GA組的細胞熒光傳遞功能顯著降低，證明oleamide和18-α-GA能降低由Cx26/Cx32組成的GJ功能。細胞集落形成實驗結(jié)果顯示：在高密度接種細胞(生長融合，有GJ形成)，用25αMoleamide和10μM18-α-GA抑制GJ功能，5μM順鉑對細胞集落形成的抑制率明顯降低，而在低密度接種細胞(生長未融合，無GJ形成)，oleamide，α-GA對順鉑的集落形成抑制率無明顯影響。結(jié)果表明降低GJ功能可降低

11、順鉑的細胞毒性。 4、增強GJ功能對順鉑細胞毒性的影響 RA是公認GJ增強劑，但未見有對由Cx26/Cx32組成的GJ功能影響的報道。細胞接種熒光示蹤實驗顯示，與對照組相比，10μMRA組的細胞熒光傳遞功能增強。結(jié)果證明，RA顯著增強由Cx26/Cx32組成的GJ功能。集落形成實驗結(jié)果顯示：在高密度接種細胞(生長融合，有GJ形成)，使用10μMRA增強GJ功能，5αM順鉑對細胞集落形成的抑制率明顯增高。而在低密度接種細胞