組織工程方法修復(fù)大鼠棘上、棘間韌帶的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：脊柱骨折的患者常并發(fā)棘上韌帶、棘間韌帶損傷。但是韌帶損傷后不愈合或瘢痕愈合，常導(dǎo)致明顯的關(guān)節(jié)功能喪失和疼痛。而且盡管韌帶損傷后可以自愈，但愈合后韌帶的超微結(jié)構(gòu)及生化構(gòu)成發(fā)生了很大改變，即使在韌帶愈合后若干年內(nèi)，其生物力學(xué)特性仍較正常韌帶差。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的學(xué)者嘗試采用生物學(xué)的方法來(lái)促進(jìn)韌帶的愈合。其主要方法有細(xì)胞因子治療、基因治療和組織工程方法等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)．作為干細(xì)胞

2、的一種，具有多方向分化的潛能。本實(shí)驗(yàn)以MSCs為種子細(xì)胞，用組織工程的方法來(lái)促進(jìn)韌帶的愈合。觀察該方法促進(jìn)大鼠棘上、棘間韌帶損傷愈合的效果。 方法：1.MSCs的體外培養(yǎng)。利用密度梯度離心法分離獲取大鼠股骨MSCs。以2.0×105/mL的密度接種于DMEM培養(yǎng)液中。原代細(xì)胞增殖達(dá)到鋪滿瓶底約80％時(shí)，按1：3比例進(jìn)行傳代。2.細(xì)胞—膠原海綿復(fù)合體的制備。在第三代細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入3mg/L BrdU培養(yǎng)24小時(shí)予以標(biāo)記。然后用

3、胰蛋白酶消化，并制成細(xì)胞懸液，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成10×106/mL的濃度，將其滴到已用紫外線消毒的膠原海綿上，5％ CO2孵育箱中37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞吸附于膠原海綿上制成細(xì)胞——膠原海綿復(fù)合體。3.動(dòng)物模型的建立。切斷大鼠LA—L5間的棘上、棘間韌帶。實(shí)驗(yàn)組將細(xì)胞—膠原海綿復(fù)合體移植于損傷處，對(duì)照組僅移植以膠原海綿。4.HE染色。于移植后第4周處死動(dòng)物，切取標(biāo)本，作組織學(xué)檢查。每個(gè)標(biāo)本選取一張切片進(jìn)行HE染色。5.免疫組化

4、染色。再次選取每個(gè)標(biāo)本的切片，做免疫組化染色。胞核棕黃色者為陽(yáng)性染色細(xì)胞。 結(jié)果：1.MSCs的體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，MSCs接種3天后即有部分細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)12—14天細(xì)胞生長(zhǎng)成單層。傳代后，MSCs增殖明顯加快9—10天既可融合成單層。2.動(dòng)物模型結(jié)果：20只動(dòng)物均存活良好。3.組織學(xué)觀察結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周可見(jiàn)6例移植處形成韌帶樣組織，可見(jiàn)形態(tài)一致、排列方向與正常組織接近的成纖維細(xì)胞，類似正常韌帶組織。對(duì)照組所形

5、成的新生組織含較多脂肪組織且細(xì)胞排列紊亂，膠原纖維呈松散網(wǎng)絲狀。兩組間愈合較優(yōu)者所占比率的差異具有顯著性(P<0.05)。4.免疫組化結(jié)果：于實(shí)驗(yàn)組切片可見(jiàn)胞核為棕褐色的陽(yáng)性細(xì)胞。對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞。 討論：MSCs為較為理想的種子細(xì)胞。使用Ⅰ型膠原作為載體也較為合理。修復(fù)損傷韌帶的部分組織來(lái)源于移植的MSCs。MSCs在不添加外源性生長(zhǎng)因子的情況下，可在體內(nèi)對(duì)韌帶缺損進(jìn)行有效修復(fù)。實(shí)驗(yàn)組韌帶恢復(fù)較好，對(duì)照組恢復(fù)的相對(duì)較差。