復(fù)合FK506-NGF-RGD多肽接枝聚(羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸)緩釋膜應(yīng)用于同種異體神經(jīng)移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景與目的 由于創(chuàng)傷、腫瘤等致大段周圍神經(jīng)缺損、變性、壞死等臨床上較為常見。治療上往往需要移植物來橋接、促進(jìn)和引導(dǎo)神經(jīng)再生。一直以來自體神經(jīng)移植是修復(fù)周圍神經(jīng)缺損最理想的手術(shù)方法，在臨床上已廣泛應(yīng)用，也是衡量各種神經(jīng)橋接材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但往往會(huì)造成供體神經(jīng)支配區(qū)感覺、功能障礙，且自體神經(jīng)來源有限。同種異體神經(jīng)移植可以解決上述問題，但如何降低或消除免疫排斥反應(yīng)并加速神經(jīng)生長是臨床工作者和基礎(chǔ)科研人員所面臨的難題。本實(shí)驗(yàn)針

2、對上述兩個(gè)難題，用RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸Arg-Gly-Asp）高分子材料并加入FK506（免疫抑制劑）、NGF（神經(jīng)生長因子）合成緩釋膜外用于移植段神經(jīng)周圍，探討其促進(jìn)神經(jīng)再生的效果。 二、方法 1、選取8只健康成年SD雄性大鼠，體重180～200g，在顯微鏡下分離并切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，制成10mm神經(jīng)段，用干燥無菌試管分裝置于-196℃液氮中，保存3周，術(shù)前取出后常溫復(fù)溫。 2、選取體重180～200

3、g，雄性SD大鼠40只為受體，隨機(jī)分為4組，每組10只。A組：單純冷凍異體神經(jīng)移植組；B組：冷凍異體神經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用FK506/RGD復(fù)合緩釋膜移植組；C組：自體神經(jīng)移植組；D組：冷凍異體神經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用FK506/NGF/RGD復(fù)合緩釋膜移植組。用濃度為0.4%的戊巴比妥鈉（40mg/kg）注入腹腔麻醉大鼠。麻醉滿意后，將大鼠俯臥固定于手術(shù)板上。左股后外側(cè)區(qū)備皮，常規(guī)術(shù)野消毒、鋪巾。沿左大腿后外側(cè)作縱行切口，切開皮膚及皮下組織。鈍性分離股二頭

4、肌與半腱肌、半膜肌，充分暴露坐骨神經(jīng)，在距梨狀肌下緣下5mm處切斷并切除坐骨神經(jīng)10mm，然后移植已處理的供體神經(jīng)。B組移植段神經(jīng)外用FK506/RGD復(fù)合緩釋膜包裹，D組外用FK506/NGF/RGD復(fù)合緩釋膜包裹，緩釋膜兩端分別固定于神經(jīng)外膜上。術(shù)后分籠喂養(yǎng)12周。 3、術(shù)后對各組大鼠進(jìn)行大體觀察，于術(shù)后12周先進(jìn)行神經(jīng)電生理學(xué)檢測，然后取雙側(cè)小腿三頭肌進(jìn)行恢復(fù)率測定、最后分別在光鏡和電鏡下對移植段神經(jīng)進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察及超

5、微結(jié)構(gòu)測定。 三、結(jié)果 1.大體觀察：術(shù)后1周內(nèi)各組大鼠行動(dòng)困難，精神萎靡，進(jìn)食少，各組動(dòng)物手術(shù)切口均未發(fā)生感染。術(shù)后第2周各組大鼠均不同程度地出現(xiàn)術(shù)側(cè)小腿及部分足趾出現(xiàn)紅腫甚至潰瘍，第8周時(shí)所有大鼠足底的紅腫和潰瘍均消退。術(shù)后4周時(shí)各組大鼠術(shù)側(cè)腿部肌肉出現(xiàn)不同程度的萎縮。術(shù)后8周時(shí)B、C、D組大鼠術(shù)側(cè)萎縮的肌肉開始恢復(fù)，其中D組大鼠恢復(fù)最為明顯。術(shù)后12周術(shù)取材時(shí)顯露移植段神經(jīng)，除A組與周圍組織有粘連外，其余各組與周圍

6、組織界限清晰，且神經(jīng)吻合口光滑，連續(xù)性良好，粗細(xì)均勻，質(zhì)地柔軟，顯微鏡下可清楚地觀察到神經(jīng)外膜豐富的新鮮血管。緩釋膜已明顯變脆、變薄。 2.電生理檢測：各組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度的測定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示：四組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=26.190，P=0.000），D組優(yōu)于A、B、C組（P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；B、C組優(yōu)于A組（P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；B、C兩組相比較無顯著性差異（P=0.348>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義）。 3.小腿三頭肌濕重恢復(fù)率測定結(jié)果：術(shù)后12周，所有大鼠術(shù)側(cè)即左側(cè)小腿三頭肌均有萎縮，小腿三頭肌恢復(fù)率測定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示：四組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=19.132，P=0.000），D組優(yōu)于A、B、C組（P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；B、C組優(yōu)于A組（P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；B、C兩組相比較無顯著性差異（P=0.351>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。 4.HE染色：術(shù)后12周移植段神經(jīng)制作切片，H

8、E染色顯示：A組神經(jīng)神經(jīng)束膜比較模糊，再生神經(jīng)纖維數(shù)目較少、軸突排列分布零散，走向紊亂；B、C兩組神經(jīng)神經(jīng)束膜比較清晰，再生神經(jīng)纖維數(shù)目較多、軸突排列分布比較均勻，走向基本一致；D組神經(jīng)神經(jīng)束膜清晰，再生神經(jīng)纖維數(shù)目最多、且清晰可見，軸突排列整齊規(guī)則，分布均勻，走向一致。 5.亞甲藍(lán)髓鞘染色：術(shù)后12周，移植段神經(jīng)行半薄切片，亞甲藍(lán)髓鞘染色顯示：A組神經(jīng)纖維密度稀疏，大小不均勻，髓鞘厚度薄，形狀各異；B、C兩組神經(jīng)纖維密度較大，

9、大小相對均勻，有髓神經(jīng)多；D組神經(jīng)纖維密度最大，有髓神經(jīng)較多，髓鞘較厚，多呈圓形。 6.圖像分析：術(shù)后12周，圖像分析顯示：四組之間的有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、軸突直徑、髓鞘厚度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=194.918，P=0.000；F=54.342，P=0.000； F=109.294，P=0.000；），D組有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、軸突直徑、髓鞘厚度均大于A、B、C組（P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；B、C組有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、軸突直徑、

10、髓鞘厚度均大于A組（P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；B、C兩組有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、軸突直徑、髓鞘厚度相比較均無顯著性差異（P=0.058>0.05； P=0.412>0.05 P=0.219>0.05差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。 7.S-100免疫組化染色：術(shù)后12周移植段神經(jīng)制作切片，S-100免疫組化染色顯示：A組、B組、C組、D組再生神經(jīng)S-100免疫組化染色均呈陽性。其中D組陽性反應(yīng)最強(qiáng)，B組、C組陽性反應(yīng)較強(qiáng)，A組陽性反應(yīng)最

11、弱。 8.透射電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)：術(shù)后12周，移植段神經(jīng)行超薄切片，鈾-鉛復(fù)染色顯示：A組圖片視野里可見結(jié)蒂組織無定形結(jié)構(gòu)中夾雜著變性神經(jīng)纖維，其髓鞘厚薄不一，雪旺氏細(xì)胞器及有髓軸突稀少，部分再生軸突髓鞘饋?zhàn)?；B、C組圖片視野里可見較多神經(jīng)纖維髓鞘增厚和比較豐富的雪旺氏細(xì)胞器，正常成熟神經(jīng)纖維與變性神經(jīng)纖維共存，比例相當(dāng)：D組圖片視野里可見大量神經(jīng)纖維髓鞘增厚和豐富的雪旺氏細(xì)胞器，且正常成熟神經(jīng)纖維居多。 四、結(jié)論