妊娠期間歇低氧誘導(dǎo)大鼠子代類(lèi)焦慮樣行為的CRH1型受體表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期應(yīng)激可以導(dǎo)致子代多種神經(jīng)精神類(lèi)疾病的易感性和行為反應(yīng)的改變。子代神經(jīng)與精神類(lèi)疾病的發(fā)生，往往來(lái)源于其胚胎發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育紊亂。這類(lèi)胎源性疾病發(fā)生的分子機(jī)制至今尚不十分清楚，目前認(rèn)為可能與胚胎發(fā)育內(nèi)環(huán)境改變與胎兒腦內(nèi)基因編碼相互作用，發(fā)生如DNA甲基化有密切的關(guān)系。
　　 母體妊娠期低氧應(yīng)激，是有害于胎兒發(fā)育的重要因素之一，其對(duì)子代健康有深遠(yuǎn)的影響。在高原地區(qū)生活或者妊娠伴有貧血癥、高血壓、呼吸睡眠

2、綜合癥和先兆子癇等疾病時(shí)，均會(huì)引發(fā)妊娠期胎兒低氧或缺氧。我們實(shí)驗(yàn)室的以往工作顯示，妊娠期間歇低氧可以導(dǎo)致HPA軸敏感化并誘發(fā)子代類(lèi)焦慮樣行為的出現(xiàn)，這與PVN區(qū)CRHR1受體的激活相關(guān)，但是CRHR1激活的分子機(jī)制尚未闡明。本論文旨在闡述妊娠期間歇性低氧誘導(dǎo)子代發(fā)生性別依賴(lài)性類(lèi)焦慮樣行為的Crhr1基因表觀遺傳修飾的分子機(jī)制。
　　 我們發(fā)現(xiàn)，妊娠期母鼠每天暴露于高原低氧（人工低氣壓艙模擬5km海拔，相當(dāng)于海平面10.8％ O2

3、）4小時(shí)，誘導(dǎo)了成年雄性子代成年大鼠類(lèi)焦慮樣行為，對(duì)雌性無(wú)影響。這種作用與生后90天(P90)子代下丘腦PVN區(qū)和胚胎發(fā)育19天(E19)下丘腦中CRHR1 mRNA高表達(dá)有關(guān)。雌性E19下丘腦CRHR1 mRNA表達(dá)下降而CRHR2 mRNA表達(dá)升高，這與CRHR1和CRHR2蛋白表達(dá)變化相一致，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)水平也明顯升高。該結(jié)果提示，在下丘腦區(qū)，CRHR2可能通過(guò)激活Ras-MAPK信號(hào)通路參與調(diào)控CRHR1

4、的下調(diào)。
　　 我們利用qPCR技術(shù)檢測(cè)了CRHR1和CRHR2的mRNA在子代生后發(fā)育期下丘腦PVN區(qū)、CeA區(qū)和垂體組織中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)在PVN區(qū)，妊娠期間歇低氧降低P7天雌性子代CRHR1 mRNA的表達(dá)水平，對(duì)P1至P21天雄性子代無(wú)影響。此外，升高P14天雌性子代CRHR2 mRNA水平，對(duì)雄性子代無(wú)明顯影響。在P7天時(shí)，雌性和雄性子代CRHR1∶ CRHR2的比值降低;在垂體組織中，妊娠期間歇低氧明顯降低P1和P1

5、4天雄性子代CRHR1 mRNA的表達(dá)，明顯升高P7天雄性子代CRHR2 mRNA表達(dá)。同時(shí)，P1天雄性子代CRHR1和CRHR2比值下降而雌性子代該比值的升高，P7天雌、雄子代CRHR1和CRHR2比值均下降;在CeA區(qū)，妊娠期間歇低氧降低P1天雄性子代CRHR1 mRNA的表達(dá)，升高P14天CRHR1 mRNA的表達(dá)，降低P7天雌性子代CRHR1mRNA的表達(dá)。妊娠期間歇低氧還可以升高P1天到P14天雌性子代CRHR2 mRNA的表

6、達(dá)，但對(duì)雄性子代無(wú)影響。P1天雌性子代和P21天雄性子代CRHR1和CRHR2比值下降，以及P7和P14天雌雄子代CRHR1和CRHR2比值下降。
　　 此外，我們應(yīng)用MethPrimer-Design Primers for Methylation PCRs軟件，分析大鼠Crhr1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的分布格局，發(fā)現(xiàn)在Crhr1基因的啟動(dòng)子區(qū)有兩個(gè)CpG島（島1和島2），島1位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-607到-502bp的區(qū)域，

7、島2則位于第一外顯子區(qū)上游-6到+429bp的區(qū)域。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，島1是調(diào)節(jié)Crhr1基因轉(zhuǎn)錄活性的主要調(diào)控區(qū)域。之后，我們對(duì)啟動(dòng)子區(qū)起主要調(diào)控作用的島1內(nèi)9個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化修飾水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示;E19天的雄性子代下丘腦區(qū)-535位胞嘧啶的甲基化修飾水平明顯降低，這與雄性子代CRHR1mRNA表達(dá)升高相一致，而E19天雌性子代-547位胞嘧啶的甲基化修飾水平明顯升高，這與CRHR1 mRNA表達(dá)降低相一致。在生后

8、發(fā)育期和成年期，在P1、P14和P90天的雄性子代PVN區(qū)，始終存在-535位CG位點(diǎn)的甲基化修飾水平的下降，同時(shí)妊娠期間歇低氧還可以導(dǎo)致P90天雄性子代PVN區(qū)Crhr1基因-587、-561、-547和-544位胞嘧啶甲基化修飾水平的下降，但對(duì)雌性子代Crhr1基因的9個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化水平無(wú)影響。在垂體組織中，妊娠期間歇低氧明顯降低P1天雄性子代-547、-544和-535位胞嘧啶的甲基化修飾水平和升高P1天雌性子代-544位胞嘧

9、啶，P14和P90天-561位胞嘧啶的甲基化修飾水平。在CeA區(qū)，妊娠期間歇低氧可以明顯升高P1天雌雄子代-552、-547、-544和-535位CG位點(diǎn)的甲基化水平，并且僅明顯升高P90雄性子代-579、-552和-547位CG位點(diǎn)的甲基化水平。此外，P90天PVN區(qū)和E19天下丘腦組織內(nèi)Crhr1基因CG位點(diǎn)甲基化修飾水平改變主要受該組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNMT3b)的調(diào)控。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，Crhr1基因啟動(dòng)子區(qū)-547位CG

10、位點(diǎn)的突變可以降低該基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性，這意味著該位點(diǎn)的堿基序列可能是影響轉(zhuǎn)錄因子與Crhr1基因結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。另外，-604位、-587位、-579位、-547位、-544位和-535位突變載體的甲基化修飾不會(huì)再引起Crhr1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下調(diào)，而-561位、-552位和-537位突變載體的甲基化修飾依然可以下調(diào)Crhr1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性活性，由此可見(jiàn)，-604位、-587位、-579位、-547位、-544位和-535位的CG

11、位點(diǎn)是影響CRHR1表達(dá)的主要位點(diǎn)。提示發(fā)育期間的Crhr1基因甲基化修飾可能受多種因素的調(diào)節(jié)，胎源起因是其中之一，同時(shí)也受到生后發(fā)育生理調(diào)節(jié)和環(huán)境變遷的復(fù)雜作用。
　　 綜上所述，妊娠期間歇低氧可以誘導(dǎo)子代類(lèi)焦慮樣行為的出現(xiàn)，并且這種行為學(xué)改變具有雄性特異性特點(diǎn)以及PVN區(qū)CRHR1 mRNA高表達(dá)的性別依賴(lài)性特點(diǎn)，提示兩者有相關(guān)性。妊娠期間歇低氧降低DNMT3b的表達(dá)，可能是低氧上調(diào)Crhr1基因表達(dá)的機(jī)制之一，也是Crhr