巨噬細胞功能極化的組蛋白二價修飾調控.pdf

1、研究背景及意義
　　巨噬細胞廣泛分布于全身各個組織和器官,在保持內環(huán)境穩(wěn)定、機體防御、炎癥調控、促進損傷修復等方面起著重要作用。巨噬細胞雖被認為是終末分化細胞,但研究表明其有一定的自我增殖能力和分化潛能,巨噬細胞在體內炎癥刺激下可轉化為淋巴內皮樣細胞,而在體外可轉化為血管內皮細胞、平滑肌細胞和成肌纖維細胞。另外,巨噬細胞在不同微環(huán)境下可激活分化為不同的功能表型,且在合適條件下還可發(fā)生重分化,具有較強的可塑性。巨噬細胞在不同微環(huán)境下

2、呈現(xiàn)不同功能表型的特點,使其在機體不同生理、病理條件下能夠發(fā)揮不同的功能,與腫瘤、代謝綜合癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。
　　靜息巨噬細胞在不同微環(huán)境下可激活分化為表型和功能迥異的兩大類型:炎癥型巨噬細胞和抗炎型巨噬細胞,又稱M1巨噬細胞和M2巨噬細胞。M1巨噬細胞由γ-IFN或γ-IFN和LPS等誘導,誘發(fā)Th1型免疫應答,起著防御細菌感染、加重炎癥反應導致組織損傷的作用。M2巨噬細胞由IL-4或IL-4和IL-13等誘導,

3、雖然由于激活條件的不同,還可以細分為M2a、M2b、M2c三種亞群,主要誘導Th2型免疫反應,防御寄生蟲感染,促進組織修復和減輕或調控炎癥免疫應答。研究發(fā)現(xiàn),M1和M2巨噬細胞在一定微環(huán)境下可分別重分化為M2樣和M1樣巨噬細胞,具有較大的可塑性。在動脈粥樣硬化和Ⅱ型糖尿病動物模型中,M2巨噬細胞可原位向M1樣表型轉化。而在腫瘤動物模型中,則觀察到在外源性IL-12的作用下,M2樣表型的腫瘤細胞可轉變?yōu)镸1樣表型,同時體外實驗也證實,M1

4、和M2巨噬細胞在分別適合M2和M1分化的條件下孵育時,細胞呈現(xiàn)出M2樣和M1樣巨噬細胞的特性。
　　功能分化巨噬細胞的重分化與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關,在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生中,正常機體脂肪組織巨噬細胞為分泌精氨酸酶-1的M2樣表型,但是隨著機體肥胖程度的增加,脂肪組織巨噬細胞由M2型向M1樣表型轉化,可分泌TNF-α、IL-6、iNOS等炎癥因子等,干擾脂肪細胞胰島素的正常信號通路,導致胰島素抵抗而誘導Ⅱ型糖尿病。類似的,在動脈

5、粥樣硬化癥中,病變部位巨噬細胞由M2型向M1樣特性轉變,也與病情的進展密切相關。而在腫瘤的發(fā)生和進展中,受腫瘤微環(huán)境的影響,腫瘤相關巨噬細胞由具有腫瘤殺傷活性的M1樣表型向M2樣表型轉化,可抑制機體免疫反應,促進腫瘤新生血管生成和腫瘤基質的重塑,最終促進腫瘤的生長和轉移。因此,對巨噬細胞功能極化可塑性機制的研究具有重要的意義,同時,對該過程機制的研究可以深化我們對細胞尤其是免疫細胞適應不同微環(huán)境機理機制的認識,為多種疾病的治療提供重要的

6、理論依據(jù)。
　　研究方法
　　1、體外誘導培養(yǎng)小鼠骨髓來源的巨噬細胞,并運用流式細胞儀檢測小鼠骨髓來源巨噬細胞的純度。
　　2、脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)分別誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞向M1巨噬細胞、M2巨噬細胞極化,采用RealtimePCR技術檢測小鼠RAW264.7巨噬細胞在不同功能狀態(tài)(M1和M2)下,特定標記基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1、MCP-1、MRmRNA

7、的表達,及調控巨噬細胞極化的轉錄因子CEBPδ、PPARγ、IRF4、IRF5mRNA的表達。
　　3、體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的巨噬細胞,運用脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)在優(yōu)化條件下分別將原代骨髓來源巨噬細胞誘導極化為M1巨噬細胞和M2巨噬細胞。采用RealtimePCR技術檢測原代骨髓來源巨噬細胞中TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1、IL-1β、iNOS、MR及轉錄因子CEBPδ、PPARγ、IRF4

8、mRNA水平的表達。
　　4、采用CCK-8試劑盒檢測不同濃度的組蛋白去乙?；敢种苿㏕richostatin(TSA)和DNA去甲基化轉移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)對小鼠骨髓來源巨噬細胞增殖能力的影響。脂多糖(LPS)誘導原代巨噬細胞向M1巨噬細胞極化,在極化過程中分別加入Trichostatin(TSA)、5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)。白介素-4(IL-4)誘導原代巨噬細胞向M2巨噬細胞極化,在此過程中分別加入T

9、richostatin(TSA)、5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)。采用RealtimePCR技術檢測巨噬細胞中TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1mRNA水平的表達變化。
　　實驗結果
　　1、本研究中,不斷改進骨髓來源巨噬細胞的體外培養(yǎng)方法。小鼠骨髓來源巨噬細胞的FITC-F4/80陽性率達到了98.6％,APC-CD11b陽性率達到了98.2%,雙陽性率為98.1%,即巨噬細胞的純度為98.1%。

10、　　2、脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)在不同時間條件下誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞向M1、M2巨噬細胞極化。LPS體外刺激巨噬細胞8h,M1巨噬細胞特定標記基因TNF-α、IL-6mRNA水平的表達最高,巨噬細胞表現(xiàn)最顯著的M1功能表型。IL-4體外刺激小鼠RAW264.7巨噬細胞24h,M2巨噬細胞特定標記基因Arginase、Fizz-1mRNA水平的表達最高,此時巨噬細胞表現(xiàn)最強的M2功能表型。
　　3、小鼠骨

11、髓來源巨噬細胞在優(yōu)化條件下分別極化為M1、M2巨噬細胞,表現(xiàn)出顯著的M1、M2功能表型。當體外刺激條件改變時,M1、M2巨噬細胞均可發(fā)生重分化。M1細胞重分化為M2樣巨噬細胞,M2細胞重分化為M1樣巨噬細胞,TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1、IL-1β、MRmRNA的表達也發(fā)生相應改變。
　　4、50nmol/L的Trichostatin(TSA)、1μmol/L的5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)對原代骨髓來源巨

12、噬細胞增殖的抑制率最小。在M1巨噬細胞極化過程中分別加入50nmol/L的Trichostatin(TSA)、1μmol/L的5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)。同時,在M2巨噬細胞極化過程中也分別加入50nmol/L的Trichostatin(TSA)、1μmol/L的5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)。結果顯示:M1、M2巨噬細胞中特定標記基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1mRNA的表達明顯增加。
　　實驗結論<

13、br>　　1、脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)在不同時間條件下刺激巨噬細胞,使巨噬細胞獲得不同的功能表型。LPS體外刺激巨噬細胞8h,使巨噬細胞獲得最顯著的M1表型,而IL-4體外刺激巨噬細胞24h則使巨噬細胞獲得最顯著的M2表型,巨噬細胞的極化是一個連續(xù)的過程,M1、M2只是極化過程的兩個極端。
　　2、功能極化的巨噬細胞(M1、M2)在體外微環(huán)境發(fā)生改變時均可發(fā)生重分化,具有較強的可塑性。
　　3、Trichos