Sorcin相互作用蛋白的篩選及其與胃癌多藥耐藥的相關(guān)研究.pdf

1、背景與目的：胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，晚期胃癌患者化療的有效率約20％-40％。胃癌的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是造成化療失敗的極為重要的原因，如何逆轉(zhuǎn)胃癌MDR，提高化療效果是當(dāng)前亟需解決的關(guān)鍵問題。近年來雖然胃痛MDR機(jī)制被廣泛研究，一些新的耐藥相關(guān)分子如核糖體S13和鋅帶基因ZNRD1等不斷被發(fā)現(xiàn)，但仍未能全面闡明其產(chǎn)生機(jī)制和找到有效的靶點(diǎn)完全逆轉(zhuǎn)胃癌MDR.，提示可能存在不為我們所知的胃癌MD

2、R機(jī)制，有必要進(jìn)一步尋找新的耐藥機(jī)制及耐藥相關(guān)基因。
　　 在我們的早期研究中，首次發(fā)現(xiàn)可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白Sorcin在胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR中表達(dá)明顯增強(qiáng)，用Sorcin寡核苷酸下調(diào)其在SGC7901/VCR中的表達(dá)，可以部分逆轉(zhuǎn)SGC7901/VCR細(xì)胞的多藥耐藥性，從而證明Sorcin與胃癌多藥耐藥密切相關(guān)。然而，目前國際上關(guān)于Sorcin在多藥耐藥細(xì)胞中的具體機(jī)制仍不十分清楚。目前研究認(rèn)為細(xì)胞中絕大多

3、數(shù)酶的功能和調(diào)控過程是以蛋白質(zhì)復(fù)合體或蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的，蛋白質(zhì)的相互作用是目前研究的熱點(diǎn)。因此，本課題旨在通過分離、鑒定Sorcin相互作用蛋白質(zhì)，探討其在胃癌多藥耐藥中的作用機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥提供新靶點(diǎn)。
　　 方法：(1)通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，RT-PCR和Western blotting分別檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Sorcin mRNA和蛋白表

4、達(dá)水平；利用FLAG標(biāo)簽的親和層析技術(shù)提純Sorcin蛋白復(fù)合體；1D-SDS-PAGE技術(shù)預(yù)分離蛋白復(fù)合體；ESI-Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定Sorcin相互作用蛋白質(zhì)；
　　 (2)采用免疫共沉淀結(jié)合Western blotting在SGC7901/VCR細(xì)胞中驗(yàn)證3個可能與Sorcin相關(guān)的蛋白質(zhì)(GSTP1、HSP70、Tubulin)；采用RT-PCR和Western blotting分別檢測SGC7901/VCR和S

5、GC7901兩種細(xì)胞中HSP70 mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異；HSP70siRNA下調(diào)HSP70在SGC7901/VCR中的表達(dá)，并給予不同濃度的長春新堿干預(yù)，采用MTT法分析細(xì)胞存活率，Hoechest33258及流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞凋亡；采用RT—PCR檢測長春新堿處理后凋亡相關(guān)基因bcl-2及bax mRNA的表達(dá)，初步探討HSP70在胃癌多藥耐藥細(xì)胞中可能的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：(1)共鑒定出72個Sorcin相關(guān)蛋白

6、質(zhì)，功能分類包括蛋白質(zhì)代謝酶類、分子伴侶、生物氧化相關(guān)酶類，細(xì)胞骨架蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白，酶解相關(guān)蛋白和一些功能未知蛋白等；(2)在Sorcin免疫復(fù)合物中檢測到HSP70、Tubulin、GSTP1蛋白，與質(zhì)譜分析結(jié)果一致；與SGC7901細(xì)胞相比，HSP70在胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中表達(dá)明顯增強(qiáng)；HSP70 siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞后，RT—PCR和Western blotting結(jié)果顯示HSP70

7、表達(dá)下調(diào)；經(jīng)過長春新堿處理后，與陰性對照組及空白對照組相比，HSP70 siRNA轉(zhuǎn)染組對長春新堿敏感性增加，細(xì)胞凋亡明顯增加；經(jīng)長春新堿處理后，SGC7901細(xì)胞中bcl-2 mRNA表達(dá)較長春新堿處理前下調(diào)約42.7％，HSP70 siRNA轉(zhuǎn)染的SGC7901/VCR細(xì)胞較陰性siRNA轉(zhuǎn)染的SGC7901/VCR細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)約28.6％；而長春新堿處理前后各組細(xì)胞bax mRNA表達(dá)均無明顯變化。
　　

8、 結(jié)論：(1)成功鑒定出72個Sorcin相互作用蛋白質(zhì)；(2)免疫共沉淀結(jié)合Western blotting的結(jié)果證實(shí)Sorcin與HSP70、Tubulin、GSTP1存在相互作用；(3)HSP70在SGC7901/VCR細(xì)胞株中呈高表達(dá)：HSP70 siRNA抑制HSP70的表達(dá)可促進(jìn)長春新堿誘導(dǎo)的bcl-2基因表達(dá)的下調(diào)，從而上調(diào)bax/bcl-2比值，促進(jìn)長春新堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)胃癌多藥耐約株SGC7901/VCR對長春