GbMYB5基因在棉花耐干旱脅迫中的功能研究.pdf

1、干旱嚴(yán)重危害作物的生產(chǎn)。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)逆境脅迫包括干旱脅迫中起著重要調(diào)控作用。克隆抗旱相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，研究其在植物中的抗旱功能和作用機(jī)制，對植物抗旱育種具有重要意義。
　　前期，本實驗室從海島棉中克隆了一個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子（GbMYB5），并通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得了過量表達(dá)GbMYB5基因的轉(zhuǎn)基因普通煙草。為了進(jìn)一步研究了GbMYB5基因在干旱脅迫中的功能，本研究通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced

2、 gene silencing，VIGS)研究GbMYB5基因在棉花中的耐旱功能，并研究過量表達(dá)GbMYB5基因的轉(zhuǎn)基因普通煙草對干旱脅迫的響應(yīng)和耐旱功能，主要研究結(jié)果如下:
　　VIGS沉默海島棉GbMYB5后，對GbMYB5沉默植株（CLCrVA-GbMYB5）、野生型植株(WT)和注射空載體植株（CLCrVA）進(jìn)行PEG模擬干旱和自然干旱研究其耐干旱功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLCrVA-GbMYB5植株、WT植株和CLCrVA植株澆灌

3、10mL18％ PEG6000水溶液2d，恢復(fù)澆水一次后，CL Cr VA-GbMYB植株葉片嚴(yán)重萎焉，而WT植株和A植株葉片恢復(fù)正常。同樣，CLCrVA-GbMYB5植株和CL CrVA對照植株自然干旱35d，然后恢復(fù)澆水一次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CL Cr VA-GbMYB5植株葉片幾乎掉落，莖失水萎縮，植株存活率約50％，而CLCrVA對照植株萎焉后恢復(fù)正常生長，存活率大約90％。VIGS結(jié)果表明抑制GbMYB5的表達(dá)量降低了棉花植株對干旱脅

4、迫的抗性。
　　利用半定量方法選擇含有GbMYB5兩株轉(zhuǎn)基因煙草株系(TP1，TP2)研究GbMYB5基因的耐旱功能。首先，將3葉期幼苗根系切除后培養(yǎng)于含有2％PEG6000的1/2MS培養(yǎng)基，3周后，發(fā)現(xiàn)TP1、TP2的地下部分和地上部分都明顯大于WT植株。其次，用25％PEG溶液浸泡轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因野生型煙草(WT)葉盤7d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TP1、TP2葉盤仍保持綠色，而WT葉盤氧化嚴(yán)重呈焦黃色。再次，對TP1、TP2和WT煙草持續(xù)

5、不澆水35d，再恢復(fù)澆水一次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分轉(zhuǎn)基因煙草恢復(fù)正常生長，非轉(zhuǎn)基因煙草萎焉嚴(yán)重甚至死亡，轉(zhuǎn)基因煙草存活率為70％-80％，而非轉(zhuǎn)基因煙草存活率只有30％。上述結(jié)果表明GbMYB5過量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草耐旱性。
　　正常生長條件下，取TP1、TP2和WT植株的倒一葉至倒三葉，室溫條件下研究離體葉片失水率，結(jié)果表明TP1、TP2葉片失水率比WT低。取自然干旱處理7d前后的TP1、TP2和WT葉片檢測植株的相對含水量，結(jié)果表

6、明自然干旱處理前，TP1、TP2和WT的相對含水量沒有顯著差異，都在88-90％左右，自然干旱7d后，TP1和TP2含水量降至73-74％，而WT含水量則減少至66％，明顯低于前者。觀察葉片氣孔發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株TP1與WT的氣孔密度無明顯差異，但TP1的氣孔尺寸明顯比WT小，TP1平均氣孔大小為33.5×112.8μm，而WT平均氣孔大小為38.2×120.6μm，且在干旱脅迫條件下，TP1氣孔張開率約45％，明顯低于WT的90％氣孔張開

7、率。在正常生長條件下，抗氧化物酶POD和SOD的活性在TP1、TP2和WT間無明顯差異，自然干旱處理7天后，TP1、TP2和WT植株體內(nèi)的POD和SOD活性都升高，但TP1、TP2植株的POD和SOD活性明顯高于WT植株。熒光定量PCR檢測抗旱相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，在自然干旱7d后，TP1和TP2編碼抗氧化物酶的基因（NtCAT、NtSOD、NtGST）參與多聚胺生物合成的基因（NtADC1、NtSAMDC）和編碼LEA蛋白的基因(N

8、tERD10D)表達(dá)水平明顯高于WT植株。上述結(jié)果表明，在干旱脅迫的條件下，GbMYB5過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草通過降低葉片失水率提高了耐旱性，并通過提高體內(nèi)抗氧化物酶的活性以及一些保護(hù)化合物（如多聚胺）和保護(hù)蛋白（如LEA蛋白）的含量，從而減輕干旱脅迫引發(fā)的活性氧、失水等對植物細(xì)胞的危害。
　　將TP1、TP2和WT種子在含有0、1、3、5μmol ABA的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽進(jìn)行ABA敏感性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GbMYB5基因過量表達(dá)