創(chuàng)傷應(yīng)激對大鼠Walker-256移植瘤生長及增殖活性的影響研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 外科手術(shù)切除腫瘤病灶是許多惡性腫瘤患者的重要治療手段，對于延長患者生存期、改善預(yù)后具有決定性的意義。腫瘤的外科手術(shù)治療大致可分為兩大類，一類為根治性切除手術(shù)，另一類則為姑息性手術(shù)。外科手術(shù)對于機(jī)體而言是一種強(qiáng)烈的創(chuàng)傷應(yīng)激，可使機(jī)體發(fā)生許多反應(yīng)，如神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)、細(xì)胞因子變化、代謝變化以及其他一些可能的生物學(xué)反應(yīng)。這些反應(yīng)在機(jī)體內(nèi)本身又存在復(fù)雜而又緊密的聯(lián)系，最終使機(jī)體內(nèi)部環(huán)境發(fā)生變化。腫瘤的形成和進(jìn)展不單

2、只與腫瘤細(xì)胞本身有關(guān)，還與其所處的生長環(huán)境密切相關(guān)，由此產(chǎn)生腫瘤微環(huán)境的概念，即腫瘤在其發(fā)生發(fā)展過程中所處的由腫瘤細(xì)胞、微血管、微淋巴管、眾多細(xì)胞因子、組織液及少量浸潤細(xì)胞等共同構(gòu)成的內(nèi)環(huán)境。腫瘤生長的微環(huán)境對于腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成具有重要意義，當(dāng)腫瘤微環(huán)境被改變時，腫瘤生長也會受到影響。機(jī)體在創(chuàng)傷應(yīng)激后產(chǎn)生一系列生物學(xué)反應(yīng)，致使機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞，從而可能影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。當(dāng)外科手術(shù)不能根治性切除腫瘤或僅為姑息性手術(shù)時，機(jī)體

3、的創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)環(huán)境的改變便可能影響體內(nèi)殘余腫瘤細(xì)胞的生長，從而利于殘余腫瘤的生長或擴(kuò)散。在這種情況下是否會使患者預(yù)后更差，臨床上缺乏長期觀察。有研究稱外科打擊后內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡和自然殺傷細(xì)胞活性的減弱可促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，將術(shù)后腫瘤加速生長的原因主要歸結(jié)于基礎(chǔ)免疫能力的減弱，這種觀點說服力有限，有待進(jìn)一步研究。已有實驗證明外科打擊可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，慢性應(yīng)激在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中亦起重要作用，而急性創(chuàng)傷應(yīng)激對腫瘤的生長影

4、響的研究并不深入。結(jié)合許多腫瘤需要手術(shù)治療這一客觀情況，研究創(chuàng)傷應(yīng)激下腫瘤的生長和增殖活性的變化，對于提高腫瘤的防治水平具有重要意義，同時可加深外科醫(yī)生對于腫瘤切除手術(shù)的理解，為患者提供更合理的治療方式。
　　 燒傷是一種典型的創(chuàng)傷應(yīng)激，燒傷和手術(shù)創(chuàng)傷對機(jī)體所造成的應(yīng)激反應(yīng)及炎性細(xì)胞因子的釋放有很多相似之處，且燒傷在實驗條件下更容易獲得，可控性強(qiáng)，可以通過改變燒傷的面積和程度來控制創(chuàng)傷的大小和程度，故選擇燒傷作為外界對機(jī)體的創(chuàng)傷

5、應(yīng)激。本實驗所選Walker-256細(xì)胞是瘤株來自大鼠乳腺的一種自發(fā)性癌肉瘤，侵襲性強(qiáng)，Wistar大鼠對其免疫排斥弱，移植后能在Wistar大鼠體內(nèi)較好地生長，是制作移植瘤模型的常用腫瘤細(xì)胞株，同時Wistar大鼠亦是制作腫瘤移植模型的常用動物，且能較好的承受燒傷打擊，是燒傷實驗常用的動物之一。實驗選取腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)等為研究效應(yīng)觀察指標(biāo)。TNF-α是主要用來反映創(chuàng)

6、傷嚴(yán)重程度的觀察指標(biāo)，血清中TNF-α水平的高低與創(chuàng)傷程度密切相關(guān)，可用來觀察燒傷造成的創(chuàng)傷程度。VEGF是參與腫瘤組織血管生成的重要因子，不僅參與腫瘤血管發(fā)生、增殖，還與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，可用來反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性和預(yù)后。本實驗不僅檢測大鼠血清VEGF水平，還用免疫組化法檢測腫瘤組織中VEGF的表達(dá)，以使實驗結(jié)果更具說服性。PCNA是能反映細(xì)胞增殖活性的一種標(biāo)志物，對細(xì)胞由G1期向S期的過渡起調(diào)節(jié)作用，其含量的變化與細(xì)胞增殖的進(jìn)

7、程同步，目前已把它作為衡量細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個客觀指標(biāo)。聯(lián)合檢測VEGF和PCNA的表達(dá)可作為評價腫瘤增殖活性和預(yù)后的可靠參考指標(biāo)。研究目的是通過燒傷來造成創(chuàng)傷應(yīng)激，觀察創(chuàng)傷應(yīng)激后一段時間內(nèi)移植瘤的重量、大鼠血清TNF-α、VEGF水平變化及腫瘤組織免疫組化染色VEGF、PCNA表達(dá)情況，通過對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，評估創(chuàng)傷應(yīng)激對大鼠移植腫瘤生長和增殖活性的影響，并探討其機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、大鼠皮下Walker-2

8、56移植瘤模型的制作:Walker-256癌細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)、傳代至對數(shù)期，取1ml注入Wistar幼大鼠腹腔傳代培養(yǎng)。1周后抽取癌性腹水，離心棄上清，取下層黏稠細(xì)胞懸液，PBS液配制成（細(xì)胞計數(shù)大于1×109/ml）乳白色含瘤懸液。取0.15ml接種于120g左右Wistar大鼠腹股溝皮下，共接種45只。3-5天后可觸及直徑約0.5cm左右皮下腫瘤結(jié)節(jié)，說明移植瘤模型制作成功。
　　 2、接種后第5天后取36只接種腫瘤成功的大鼠（

9、部分接種失敗不予入組）完全隨機(jī)分成3組(n=12):A組（對照組）僅背部去毛，不予燒傷處理;B組（輕度燒傷組）背部去毛并予100℃開水燙傷5s，燒傷面積3×3cm;C組（重度燒傷組）背部予100℃開水燙傷10s，燒傷面積4×4cm。具體操作在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行，燙傷后觀察至大鼠蘇醒后分籠飼養(yǎng)，并提供充足食物和水。
　　 3、燒傷后第10天處死三組所有大鼠，心臟取血，離心，取上層血清。血清VEGF、TNF-α定量試劑盒測定血清VEGF

10、、TNF-α濃度，檢測方法參照試劑盒測試說明書進(jìn)行。取血后沿腫瘤包膜完整分離皮下腫瘤組織，測其重量，置于福爾馬林液中保存。
　　 4、分離的腫瘤組織常規(guī)固定，石蠟包埋，切片，免疫組化法檢測腫瘤組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及PCNA表達(dá):采用SABC法，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。VEGF陽性判定為腫瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色，定義VEGF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＜10％為(-)，≥10％為(+)，記錄各組腫瘤組織VEGF陽性

11、和陰性例數(shù)。細(xì)胞PCNA陽性染色表現(xiàn)為僅限于細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆?；驈浡苑植?，計數(shù)每個視野中的PCNA陽性細(xì)胞數(shù)和計數(shù)細(xì)胞總數(shù)，以PCNA陽性細(xì)胞數(shù)的百分率代表增殖指數(shù)并記錄。
　　 5、統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量數(shù)據(jù)采用(x±s)表示，腫瘤質(zhì)量、血清TNF-α、血清VEGF、腫瘤組織PCNA增殖指數(shù)的比較采用單因素方差分析(OnewayANOVA)進(jìn)行分析，均數(shù)間的多重比較采用SNK-q檢驗;腫瘤

12、組織VEGF陽性率的比較采用X2檢驗方法，均以α=0.05作為差異有顯著意義的檢驗水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、與A組（對照組）相比，燒傷組腫瘤質(zhì)量增大（A組2.81±0.48g，B組3.28±0.61g，C組3.40±0.47g，P=0.022＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義）。B、C兩組間無顯著性差異(P=0.589)。
　　 2、燒傷組大鼠血清TNF-α較對照組升高（A組31.59±4.73pg/ml，B組

13、41.72±4.80pg/ml，C組42.47±5.32pg/ml，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義）。燒傷組血清VEGF值升高（A組189.04±27.43pg/ml，B組221.53±26.55pg/ml，C組214.73±37.98pg/ml，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義）。兩項指標(biāo)在B、C兩組間均無顯著性差異（分別為P=0.713和P=0.388）。
　　 3、大鼠腫瘤組織免疫組化PCNA表達(dá)結(jié)果:燒傷組大鼠腫瘤組織

14、中PCNA的表達(dá)要高于對照組（A組58.30±6.61％，B組77.08±4.53％，C組81.58±4.56％，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義），C組PCNA表達(dá)要高于B組（P=0.024＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義）。
　　 4、大鼠腫瘤組織免疫組化VEGF表達(dá)結(jié)果:與對照組相比，燒傷組VEGF陽性例數(shù)增多（分別為A組4例，B組9例，C組10例，X2=7.465，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義）。
　　 討論：

15、
　　 目前越來越多的人認(rèn)為腫瘤所處的局部微環(huán)境對腫瘤的生長起著不可忽視的作用，當(dāng)腫瘤微環(huán)境被改變時，腫瘤生長也會受到影響。創(chuàng)傷后機(jī)體將作出應(yīng)激反應(yīng)，激活下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)，血液中的去甲腎上腺素、皮質(zhì)醇等應(yīng)激激素大量釋放，導(dǎo)致血管痙攣，加重組織缺血、缺氧。此外，激素對機(jī)體的免疫系統(tǒng)有抑制作用，在腫瘤微環(huán)境中浸潤的免疫細(xì)胞，其抗腫瘤效應(yīng)的下調(diào)有利于惡性腫瘤的進(jìn)展、新生血管的形成及向特定部位的轉(zhuǎn)移。燒傷后

16、炎癥應(yīng)答反應(yīng)還會釋放大量的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6等，可使機(jī)體免疫功能紊亂，且這些細(xì)胞因子本身就可能會對腫瘤細(xì)胞生長產(chǎn)生影響。創(chuàng)傷后機(jī)體基礎(chǔ)免疫能力減弱，血液中的淋巴細(xì)胞減少。VEGF是參與腫瘤新血管形成的重要生長因子，而創(chuàng)傷后可以造成血清VEGF水平升高。因此，創(chuàng)傷后在多種因素共同作用下為腫瘤的生長提供了一個有利環(huán)境。本實驗研究結(jié)果顯示，創(chuàng)傷應(yīng)激使腫瘤生長速度加快，大鼠血清TNF-α、VEGF水平升高，腫瘤組織PCNA、V