補(bǔ)腎方藥有效成分配伍對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞生物學(xué)活性的實(shí)驗(yàn)性比較研究.pdf

1、目的：骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種全身性代謝性骨病，是目前世界上發(fā)病率、死亡率及保健費(fèi)用消耗較大的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界目前約有2億人患有骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松癥發(fā)病?！办o悄悄”，“不知不覺”，一旦發(fā)現(xiàn)多已經(jīng)發(fā)展到一定程度，因此越來越引起人們的重視。從細(xì)胞學(xué)水平上來研究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)理及其藥效評(píng)價(jià)已經(jīng)成為基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡在維持骨的正常結(jié)構(gòu)和代謝中具有重要作用。骨質(zhì)疏松是由于骨吸收

2、和骨形成解偶聯(lián)，骨吸收大于骨形成導(dǎo)致骨量丟失而引起。大量資料顯示：成骨細(xì)胞的增殖抑制、分化程度降低是造成骨質(zhì)疏松的重要原因。
　　 中醫(yī)藥學(xué)（TCM）認(rèn)為骨與腎的關(guān)系密切，其在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松及骨折方面存在著悠久的歷史。祖國(guó)醫(yī)學(xué)古典醫(yī)籍《黃帝內(nèi)經(jīng)》中，有很多類似于骨質(zhì)疏松的名稱的記載，歷代也有不少治療骨質(zhì)疏松的名方。本實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)腎方藥由熟地黃、淫羊藿、山藥、丹參、骨碎補(bǔ)、獨(dú)活組成。有效部位的單體化合物依次是梓醇、淫羊藿苷、薯蕷皂

3、苷元、丹參酮ⅡA、柚皮苷、羥甲香豆素。
　　 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（Cell culture technique），是生命科學(xué)研究中一個(gè)必不可少的技術(shù)。我們多次酶消化-貼塊法對(duì)SD大鼠原代成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)，而獲得足夠數(shù)量的成骨細(xì)胞。首先觀察成骨細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中的形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)而以體外培養(yǎng)的SD大鼠成骨細(xì)胞5～6代為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用補(bǔ)腎方藥不同單體配伍、生藥配伍、淫羊藿苷單體進(jìn)行成骨細(xì)胞干預(yù)性培養(yǎng)，在不同濃度、不同時(shí)間及不同配伍的情況下，

4、采用噻唑藍(lán)法（MTT）和對(duì)硝基苯二鈉基質(zhì)動(dòng)力學(xué)法（pNPP）分別對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的增殖與分化進(jìn)行測(cè)定。通過比較和觀察補(bǔ)腎方藥不同配伍對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化的影響，從而初步確定補(bǔ)腎方藥及其組分配伍有效性及其有效濃度范圍。
　　 方法：
　　 1、我們選用新生（<24h）SD大鼠顱蓋骨為試驗(yàn)材料，采用多次酶消化-貼塊法對(duì)大鼠原代成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡下對(duì)原代成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀察；
　　 2、補(bǔ)腎方藥的配伍

5、分組：依據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論和方劑學(xué)配伍規(guī)律將補(bǔ)腎方藥中“地黃+淫羊藿+山藥”和“骨碎補(bǔ)+丹參+獨(dú)活”各分為一類，即：“補(bǔ)藥”（Tonics Medicine，TMed）和“瀉藥”（Cathartic Medicine，CMed）。
　　 “補(bǔ)藥”（TMed）和“瀉藥”（CMed）分為生藥（Crude Drug）（原藥直接提取的成分）和單體（monomer）（有效化學(xué)成分）兩種，稱為“補(bǔ)藥生藥配伍組（crude Tonics Herb

6、s Compatibility Groups，cTHCG）”和“瀉藥生藥配伍組（crude Cathartic Herbs Compatibility Groups，cCDCG）”，分別用“CT”組和“CC”組表示；“補(bǔ)藥單體配伍組（monomer Tonics Drug Compatibility Group，mTDCG）”和“瀉藥單體配伍組（monomer Cathartic Drug Compatibility Group，mCD

7、CG）”分別用“MT”和“MC”表示。補(bǔ)腎方藥的試驗(yàn)分組：分8組，①CT>CC組，②CT=CC組，⑧CTMC組，⑥MT=MC組，⑦M(jìn)T　　 3、補(bǔ)腎方藥配伍的用藥比例：
　　 “補(bǔ)藥”（TMed）>“瀉藥"（CMed）：地黃：淫羊藿：山藥：骨碎補(bǔ)：丹參：獨(dú)活（2：2：2：1：1：1）；<

8、br>　　 “補(bǔ)藥”（TMed）=“瀉藥”（CMed）：地黃：淫羊藿：山藥：骨碎補(bǔ)：丹參：獨(dú)活（1：1：1：1：1：1）；
　　 “補(bǔ)藥”（TMed）<“瀉藥”（CMed）：地黃：淫羊藿：山藥：骨碎補(bǔ)：丹參：獨(dú)活（1：1：1：2：2：2）；
　　 4、用噻唑藍(lán)比色法（MTT）法測(cè)成骨細(xì)胞的增殖；加入濃度各為10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml的補(bǔ)腎方藥及中藥單體；繼續(xù)培養(yǎng)24h、28h、72h后，加入MTT2

9、0μl，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，觀察對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響。
　　 5、用對(duì)硝基苯二鈉基質(zhì)動(dòng)力學(xué)法（pNPP）測(cè)定大鼠成骨細(xì)胞的分化；換上補(bǔ)腎方藥及中藥單體，加藥濃度各為10ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml后；繼續(xù)培養(yǎng)24h、28h、72h后，吸棄培養(yǎng)液，加入0.25ml0.1％Triton溶液，按試劑盒說明測(cè)定，結(jié)果以每克蛋白中堿性磷酸酶（ALP）的國(guó)際單位（U/g protein）表示，該方法通過對(duì)ALP含量的測(cè)

10、定，進(jìn)而可反映OB的分化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、多次酶消化-貼塊法大鼠原代成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察
　　 1.1倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，原代成骨細(xì)胞由大鼠顱蓋骨周爬出，貼壁、展開，呈多邊形、三角形；剛接種的成骨細(xì)胞呈球形，24h內(nèi)存活細(xì)胞已沉降貼壁，完全展開，呈三角形、梭狀形，核明顯增大；傳代培養(yǎng)5天，細(xì)胞形態(tài)可見多樣化；培養(yǎng)8～15天，可見長(zhǎng)索性、多角形、條索形，匯合時(shí)細(xì)胞呈鋪路石狀，可重疊生長(zhǎng)；1

11、5天后，可出現(xiàn)膠原堆積和鈣鹽沉積。
　　 1.2堿性磷酸酶染色可觀察到成骨細(xì)胞酶活性部位呈現(xiàn)紫色細(xì)顆粒狀。
　　 2、MTT法測(cè)定補(bǔ)腎方藥對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的增殖
　　 2.1與對(duì)照組相比，濃度為10ng/ml時(shí)，在24 h測(cè)定MT>MC組增高（P<0.05）；在48h測(cè)得CT>CC組，CT=CC組，MT>MC組，有明顯促增殖作用（P<0.05）；在72 h濃度下，MT>MC組具有顯著促增殖作用（P<0.05）；

12、r>　　 2.2與對(duì)照組相比，濃度為20ng/ml時(shí)，在24 h測(cè)定CT>CC組和MT>MC組有促增殖作用（P<0.05）；在48h測(cè)得CT>CC組、MT>MC組具有促增殖作用，以CT>CC組明顯（P<0.05）；在72 h，CT>CC和MT>MC組具有促增殖作用（P<0.05）；
　　 2.3與對(duì)照組相比，濃度為30ng/ml下，在24 h測(cè)定CT>CC組有明顯促增殖作用（P<0.05）；在48h測(cè)得CT>CC組，MT>MC

13、組，MTCC組促增殖作用強(qiáng)（P<0.05）；
　　 3、對(duì)硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)動(dòng)力學(xué)法（PNPP）測(cè)定補(bǔ)腎方藥對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的分化影響
　　 3.1與對(duì)照組相比，濃度為10 ng/ml時(shí)，在24 h是測(cè)定MT>MC組ALP增高P<0.05）；在48h測(cè)得MT>MC組有明顯促ALP作用（P<0.05）；在72h測(cè)得結(jié)果，MT>MC組，MT=MC組的ALP含量明顯升

14、高，（P<0.05）；
　　 3.2與對(duì)照組相比，濃度為20ng/ml時(shí)，在24 h測(cè)定CT>CC組、CT=CC組、MT>MC組和MT=MC組有促ALP作用（P<0.05）；在48h和72 h測(cè)定ALP的含量，CT>CC組有明顯的促ALP分泌作用（P<0.05）；
　　 3.3與對(duì)照組相比，濃度為30ng/ml下，在24h是測(cè)定CT>CC組、MT>MC組有促ALP分泌作用，CT>CC組較明顯（P<0.05）；在48h和7

15、2 h測(cè)得CT>CC組有促明顯的促ALP分泌作用（P<0.05）；
　　 結(jié)論：
　　 1、補(bǔ)藥單體配伍組>瀉藥單體配伍組（MT>MC）在10ng/ml濃度72h時(shí)測(cè)得的結(jié)果最高，推斷低濃度的單體配伍對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化具有促進(jìn)作用；
　　 2、補(bǔ)藥單體配伍組>瀉藥單體配伍組（MT>MC）可能具有量-效和時(shí)-效關(guān)系。推斷其量效關(guān)系為：隨著濃度（劑量）的增加對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化作用反而減弱；同一濃度下，

16、24h與72h相比較推斷其時(shí)-效關(guān)系：72h時(shí)具有明顯的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用；
　　 3、補(bǔ)藥生藥配伍組>瀉藥生藥配伍組（CT>CC）在30ng/ml時(shí)具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用，推斷其量-效和時(shí)-效關(guān)系為：隨著濃度（劑量）和時(shí)間的增加對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化作用而增強(qiáng)；
　　 4、補(bǔ)藥>瀉藥（TMed>CMed）的配伍關(guān)系，對(duì)成骨細(xì)胞具有更好的干預(yù)效果；就本方劑來講起效部位可能是梓醇、淫羊藿苷、薯蕷皂苷