白芍總苷對系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣小鼠的治療作用及對TH17-Treg細胞免疫失衡的影響.pdf

1、目的和意義: 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種可以引起全身多個系統(tǒng)損害的慢性非器官特異性自身免疫性疾病，其血清中含有以抗核抗體為主的大量不同的自身抗體。SLE早期臨床表現(xiàn)多種多樣，初發(fā)時可僅累及單個器官，如皮膚、腎臟、關(guān)節(jié)等，也可多個器官同時受累。關(guān)節(jié)及皮膚表現(xiàn)為本病最常見的早期癥狀，其次是發(fā)熱、光敏感、雷諾現(xiàn)象、腎炎及漿膜炎等。SLE廣泛分布于世界各地，全世界的患病率約為17～48/10萬，中國大陸的調(diào)查顯示SLE的患病率為40～70/

2、10萬[1]。SLE好發(fā)于青年女性，多見于15～45歲，男女之比1∶7～9。SLE的發(fā)病原因尚不清楚，目前發(fā)現(xiàn)與本病有關(guān)的因素主要包括遺傳、病毒感染、環(huán)境、藥物等有關(guān)。本病的發(fā)病機理迄今尚未完全闡明，但大量研究研究證明SLE是一種自身免疫性疾病，遺傳、環(huán)境、病毒等多因素的相互作用致使機體自身組織細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，免疫活性細胞數(shù)量及功能異常，從而引起免疫平衡的紊亂，使機體對自身組織產(chǎn)生異常免疫反應(yīng)（包括體液免疫和細胞免疫），正常組織被自身

3、免疫細胞或自身抗體破壞而發(fā)病。
　　 SLE產(chǎn)生的自身抗體多種多樣，但主要是B細胞對核酸及其結(jié)合相關(guān)蛋白的應(yīng)答而產(chǎn)生的IgG型自身抗體，這類抗體的產(chǎn)生需要Th細胞協(xié)助。近年大量研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞根據(jù)發(fā)育、功能及分泌細胞因子的作用不同，分成Th1細胞、Th2細胞、Treg細胞和Th17細胞四個亞群。Th1和Th2細胞為兩類重要的介導(dǎo)免疫反應(yīng)的效應(yīng)性T細胞，二者相互調(diào)控，維持機體免疫穩(wěn)態(tài)。來自國內(nèi)外不同動物模型及人類SLE的研究

4、顯示，SLE患者Th1/Th2偏離方向至今尚未定論。目前關(guān)于SLE體內(nèi)Th1/Th2誰占優(yōu)勢尚無統(tǒng)一定論，Th1優(yōu)勢假說認為Th1細胞與病情活動初期及加重有關(guān);以Th1型免疫紊亂占主導(dǎo)的SLE患者多表現(xiàn)為嚴重的機體組織損害。Th2優(yōu)勢假說認為Th2細胞及其產(chǎn)生的細胞因子輔助B淋巴細胞活躍產(chǎn)生大量自身抗體，從而導(dǎo)致SLE的發(fā)病。目前多認為SLE患者體內(nèi)存在Th2優(yōu)勢，但也有實驗研究發(fā)現(xiàn)Th1優(yōu)勢的存在。
　　 Th17細胞以分泌I

5、L-17(IL-17A)而得名，除此之外，還分泌IL-17F、IL-21、IL-22及TNFα，能夠誘導(dǎo)局部細胞分泌吸引中性粒細胞的細胞因子和趨化因子，從而在介導(dǎo)慢性炎癥、防御胞外細菌感染及自身免疫性疾病等過程中發(fā)揮重要作用。
　　 調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是近年在人和小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的CD4+T細胞亞群，其可通過不同途徑作用于多種靶細胞，對機體免疫應(yīng)答進行精細的負向調(diào)節(jié)，從而穩(wěn)定機體免疫平衡、維持機體免疫耐受。根

6、據(jù)其產(chǎn)生的細胞因子、表面標(biāo)記的不同，Treg細胞可分為CD4+CD25+Treg細胞、Tr1和Th3等多種亞型。CD4+CD25+Treg細胞被認為是調(diào)節(jié)性T細胞家族中最主要的一群，叉頭狀家族轉(zhuǎn)錄因子(FoxP3)是其特異的標(biāo)記，在調(diào)節(jié)性T細胞的發(fā)育和發(fā)揮功能過程中起到關(guān)鍵作用。許多研究證實FoxP3表達的增加可以誘導(dǎo)CD4+CD25-T細胞向CD4+CD25+Treg細胞分化[2]。介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17細胞與介導(dǎo)免疫耐受的Treg細

7、胞都來源于初始T細胞，兩者的分化和功能相互抑制，在正常情況下兩者保持平衡，以維持機體免疫穩(wěn)定狀態(tài)，是對Th1/Th2免疫平衡理論的重要補充。二者失衡則可能導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生。我們推測Th17細胞/Treg細胞數(shù)量和功能的失衡可能參與了SLE的發(fā)病及病情的發(fā)展。
　　 SLE患者大多需要長期使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑，但其諸多毒副作用易造成患者的再次傷害，患者依從性較差。且糖皮質(zhì)激素的使用遵循嚴格的禁忌癥，如活動性消化道

8、潰瘍、嚴重高血壓、精神病、糖尿病、骨質(zhì)疏松、青光眼及抗菌藥不能控制的感染等，同樣限制了其臨床應(yīng)用。白芍總苷(TGP)是近年從傳統(tǒng)中藥白芍(Pall)根中提取的有效成分，主要含有芍藥苷(PF)、芍藥內(nèi)酯苷(Alb)、羥基芍藥苷、芍藥花苷、苯甲酰芍藥苷等成分，其中芍藥苷含量占總苷的90％以上，一般認為是白芍總苷的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，TGP具有多途徑調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)，能夠抑制單核巨噬細胞產(chǎn)生和分泌炎性細胞因子，清除氧自由基、影響細

9、胞增殖以及抗炎、止痛、抗應(yīng)激、保肝等作用，近年來在臨床上已廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE等風(fēng)濕免疫性疾病，不良反應(yīng)輕微且可以耐受。經(jīng)查閱文獻，尚未見關(guān)于TGP對SLE背景下Th17/Treg數(shù)量影響的報道。
　　 流式細胞術(shù)(FCM)是七十年代發(fā)展起來的高新科學(xué)技術(shù)，它集計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)、細胞免疫學(xué)于一體，同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀，還可檢測細胞表而和細胞漿抗原、細

10、胞內(nèi)DNA、RNA含量等，可對群體細胞在單細胞水平上進行分析，在短時間內(nèi)檢測分析大量細胞，并收集、儲存和處理數(shù)據(jù)，進行多參數(shù)定量分析;能夠分類收集并分選某一亞群細胞，分選純度＞95％。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。本課題利用流式細胞術(shù)檢測TGP對狼瘡鼠外周淋巴組織中Th17/Treg細胞數(shù)量的影響。
　　 本研究擬采用品系為MRL/1pr的狼瘡樣小鼠為實驗對象，研究有效劑量內(nèi)不同濃度白芍總苷隨用藥時

11、間延長對狼瘡樣小鼠尿蛋白含量及抗ds-DNA的影響，利用流式細胞檢測技術(shù)觀察白芍總苷對狼瘡樣小鼠脾淋巴細胞中CD4+IL-17+T細胞（Th17細胞）及CD4+CD25+Foxp3+T細胞（Treg細胞）數(shù)量的影響，初步探討白芍總苷對狼瘡鼠的治療作用及對外周淋巴組織Th17/Treg細胞數(shù)量的調(diào)控作用及免疫機制，進一步完善SLE外周Th17/Treg細胞失衡機制的學(xué)說，填補國內(nèi)外研究關(guān)于白芍總苷對SLE背景下Th17/Treg細胞平衡的

12、調(diào)控作用理論的空白。
　　 研究方法:
　　 1、采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測IgG型抗ds-DNA抗體濃度。
　　 2、采用考馬斯亮藍法檢測小鼠尿蛋白含量。
　　 3、采用流式細胞術(shù)檢測不同處理組狼瘡小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD25+Foxp3+T細胞、CD4+IL-17+T細胞分別占CD4+T細胞的百分率，計算CD4+IL-17+T細胞/CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例。并分析小鼠尿

13、蛋白分別與Th17/CD4+T細胞、Treg/CD4+T細胞及Th17/Treg細胞的相關(guān)性。
　　 研究內(nèi)容和過程1.實驗分組:20只MRL/1pr小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，雌性，3月齡，檢疫合格，并且在整個實驗過程中，該批小鼠一直飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心SPF級實驗動物室內(nèi)。檢測出小鼠血清抗ds-DNA抗體及尿蛋白陽性時確立狼瘡發(fā)病模型。采用隨機數(shù)字表法分為TGP高濃度組（7只）、TGP低濃度組（7只）和對照組（6

14、只）。根據(jù)《人與動物間體表面積折算的等效劑量比值表》[3]折算，TGP高濃度組按給予121mg/kg的TGP懸液灌胃，TGP低濃度組給予81mg/kg的TGP懸液灌胃，對照組給予同等體積（0.2ml/10g體重）純凈水灌胃，均每天1次，連續(xù)4周。
　　 2.研究方法
　　 (1)每日定時觀察各組小鼠毛發(fā)、行為活動、精神狀態(tài)、攝食、活動等一般情況并每日記錄。
　　 (2)分別于用藥后第0周、第2周末清晨固定時間經(jīng)眼

15、眶后靜脈叢采血0.2～0.3ml，第4周末心臟采血0.2～0.3ml，離心，取血清，-80℃冰箱中保存，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)集中檢測IgG型抗ds-DNA抗體濃度;同時利用代謝籠收集24小時尿液置于-80℃冰箱中保存，考馬斯亮藍法集中檢測尿蛋白含量。
　　 (3)于用藥4周后集中處死小鼠，解剖取出脾臟，制備脾臟單細胞懸液行流式細胞術(shù)檢測脾臟CD4+CD25+Foxp3+T細胞、CD4+IL-17+T細胞分別占CD4+T細

16、胞的百分率，計算出CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+IL-17+T細胞比例。并分析小鼠尿蛋白分別與Th17細胞、Treg細胞及二者比例的相關(guān)性。
　　 3.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 (1)所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理分析:各計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示。
　　 (2)三個時段各組尿蛋白及抗ds-DNA抗體濃度的比較用采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。各個時段內(nèi)不同處理組之間數(shù)據(jù)的比較采用單向方

17、差分析。滿足方差齊性時，各組均數(shù)間的多重比較用LSD方法分析;不滿足方差齊性時，使用Welch方法分析，各組間均數(shù)間的多重比較使用校正的多重比較方法(Dunnett's T3)方法進行分析。
　　 (3) CD4+CD25+Foxp3+T細胞、CD4+IL-17+T細胞分別占CD4+T細胞的百分率、及CD4+IL-17+T細胞/CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例的比較使用單向方差分析。方差齊性分析同上。
　　 (4

18、)分析尿蛋白分別與CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T細胞、CD4+IL-17+T/CD4+T細胞的百分率及CD4+IL-17+T/CD)4+CD25+Foxp3+T細胞的相關(guān)性時，采用雙變量相關(guān)性分析，各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布時采用Pearson相關(guān)分析，不服從正態(tài)分布時則用Spearman相關(guān)分析。
　　 (5)以P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、一般狀況:用藥前三組小鼠的攝

19、食活動正常，自主活動靈敏自如，毛發(fā)光澤。隨著時間的推移，對照組小鼠逐漸出現(xiàn)精神倦怠、喜蜷臥，攝食次數(shù)較前減少，活動次數(shù)減少，活動靈敏度下降，毛發(fā)光澤度下降，其中4只小鼠頸背部毛發(fā)脫落明顯。TGP低濃度組與高濃度組攝食活動及活動次數(shù)、靈敏度較發(fā)病前無明顯改變，無明顯毛發(fā)脫落，僅毛發(fā)光澤度較前有所下降。實驗過程中各組小鼠眼、耳、鼻、口均未見異常分泌物;大便無稀爛，尿量未見異常，尿液肉眼透明;全部小鼠均無死亡。
　　 2、抗ds-DN

20、A抗體濃度變化:用藥前及用藥2周后，三組小鼠的抗ds-DNA抗體濃度無顯著差異(P＞0.05);用藥四周后，TGP處理組抗ds-DNA抗體水平均顯著高于對照組(P=0.000，P=0.000)。
　　 TGP高濃度組抗ds-DNA抗體濃度隨時間推移呈逐漸上升趨勢，第4周末顯著高于0周和2周末(P=0.002，P=0.005)，第0周與第2周無顯著性差異(P=0.835);TGP低濃度組抗ds-DNA抗體濃度在第4周末顯著高于0周

21、和2周末(P=0.019，P=0.000)，第0周與第2周無顯著性差異(P=0.933);對照組抗ds-DNA抗體水平在三個時間段內(nèi)呈逐漸上升的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.460, P=0.257, P=0.122)。
　　 3、尿蛋白濃度變化:用藥前及用藥2周后，三組小鼠的尿蛋白濃度無顯著差異(P＞0.05);用藥4周后，TGP高濃度組顯著低于TGP低濃度組(P=0.005)，TGP高濃度組及低濃度組均顯著低于對照組(

22、P=0.014、P=0.04)。
　　 TGP高濃度組用藥4周后分別與用藥2周后、用藥前比較，其尿蛋白變化均有顯著差異(P=0.003，P=0.006)。TGP低濃度組尿蛋白呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組小鼠尿蛋白第4周末分別與第2周末及用藥前相比顯著升高(P=0.048，P=0.007)。
　　 4、脾臟CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞的百分率:脾臟CD4+CD25+Foxp3+

23、T細胞占CD4+T細胞的百分率隨著TGP濃度的增加呈逐漸遞增趨勢，其水平依次是:0.49±0.13％、0.53±0.04％、0.97±0.20％。其中，TGP高濃度組脾淋巴細胞中CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞的百分率分別顯著高于TGP低濃度組(P=0.031)與純凈水對照組(P=0.025)，TGP低濃度組高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.84)。
　　 5、CD4+IL-17+T細胞占CD4+T細胞

24、的百分率:脾淋巴細胞中CD4+IL-17+T細胞占CD4+T細胞的百分率隨著TGP濃度的增加呈逐漸遞減趨勢，其水平分別是:6.02±3.06％、4.63±1.21％、3.20±0.83％，但各組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(PH-L=0.598，PH-C=0.321，PL-C=0.607，P＞0.05)。
　　 6、脾淋巴細胞中脾淋巴細胞中CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例:脾淋巴細胞中CD4+IL-17+T

25、/CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例隨著TGP濃度下降呈上升趨勢，其水平分別是:4.27±1.28、8.91±2.20、12.38±3.82。TGP高濃度組CD4+IL17+T/CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例顯著高于對照組(P=0.049)，TGP低濃度組低于純凈水對照組、高于TGP高濃度組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.357、P=0.224)。
　　 7、三組小鼠尿蛋白分別與 CD4+IL-17+T/CD4+T

26、細胞、CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T細胞及CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T細胞行相關(guān)性分析。
　　 CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T細胞百分率與小鼠尿蛋白濃度呈顯著負相關(guān)（r=-0.481，P=0.032）;CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T細胞比值與尿蛋白濃度呈顯著正相關(guān)(r=0.609，P=0.006); CD4+IL-17+T/CD4+T細胞百分率與尿

27、蛋白無顯著相關(guān)性(r=0.301，P=0.198)。
　　 結(jié)論:
　　 1、TGP能夠改善MRL/1pr狼瘡樣小鼠的一般情況，如維持正常的精神狀態(tài)、攝食活動、保持毛發(fā)光澤度、自主活動靈敏度等，提示TGP對小鼠狼瘡樣病變狀態(tài)具有一定的改善，可以提高狼瘡樣小鼠的生存質(zhì)量。
　　 2、TGP能夠減少SLE模型小鼠尿蛋白含量，且在有效劑量內(nèi)隨著用藥劑量越大，用藥時間越長，其效果越顯著。
　　 3、TGP組狼瘡鼠

28、外周血抗ds-DNA抗體升高，同時其尿蛋白含量減少，提示TGP改善狼瘡腎臟損害，起到保護腎臟的作用在用藥早期可能并非通過減少抗ds-DNA抗體實現(xiàn)。抗ds-DNA抗體可能并非狼瘡腎的唯一致病因素。
　　 4、TGP能夠降低狼瘡鼠脾臟CD4+IL-17+T細胞水平，提高CD4+CD25+Foxp3+T細胞水平，使Th17/Treg細胞比值降低，并呈藥物濃度依賴性，提示TGP能夠負向調(diào)節(jié)狼瘡小鼠Th17/Treg細胞平衡，進而發(fā)揮抗

29、炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。
　　 5、外周CD4+CD25+Foxp3+T的數(shù)量與小鼠尿蛋白濃度呈顯著負相關(guān)，提示CD4+CD25+Foxp3+T參與保護狼瘡腎臟損害。CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T細胞比值與狼瘡鼠尿蛋白濃度呈顯著正相關(guān)，提示SLE患者可能存在Th17/Treg細胞免疫失衡，且與腎臟損害有關(guān)。
　　 6、TGP具有調(diào)節(jié)SLE Th17/Treg免疫平衡的能力。其中TGP上調(diào)Treg細胞