百草枯中毒流行病學特征及白藜蘆醇對抗其肺損傷的研究.pdf

1、隨著除草劑的廣泛應用,百草枯中毒日漸普遍,現(xiàn)已成為繼急性有機磷中毒之后的常見農(nóng)藥中毒,且呈逐年上升趨勢。絕對死亡病例數(shù)居近幾年農(nóng)藥中毒的第一位。百草枯(paraquat,PQ)又名對草快,國內(nèi)商品名為克茺蹤,化學名稱為1.1’-二甲基-4.4’聯(lián)吡啶二硫甲酯二氧化物,是目前世界上廣泛使用的有機雜環(huán)類接觸性脫葉除草劑,對人畜有較強毒性。百草枯可經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道吸收進入人體,口服吸收率為5％～15％,吸收后1～4 h血漿濃度可達到峰值

2、。百草枯進入人體后可使肺、腎、肝和胰腺出現(xiàn)損傷,其特征性的改變是肺損傷,早期表現(xiàn)為上皮細胞受損、肺泡內(nèi)出血水腫、炎性細胞浸潤,晚期則出現(xiàn)肺泡內(nèi)及肺間質(zhì)纖維化,導致急性呼吸窘迫,是百草枯中毒死亡患者的主要因為。
　　 白藜蘆醇(Resveratrol,Res)在植物界中分布非常廣泛,已在21科、31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)有白藜蘆醇,如葡萄科的葡萄屬、豆科的落花生屬和決明屬、百合科的藜蘆屬等。白藜蘆醇是這些植物為抵抗外界刺激如紫外線、

3、真菌、病毒感染或機械損傷而產(chǎn)生的一種植物抗毒素(phytoalexin)。研究表明,白藜蘆醇能抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基,具有保護肝臟、神經(jīng)、心血管系統(tǒng)的功能,具有調(diào)節(jié)免疫、植物雌激素的作用,還有影響骨代謝和拮抗內(nèi)皮素等生物學作用。
　　 RLE-6TN細胞株是大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞。肺泡上皮細胞特別是Ⅱ型上皮細胞在百草枯相關肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中起著極其重要的作用。Ⅱ型上皮細胞(AT Ⅱ)是肺泡上皮細胞的“干細胞”,它

4、的功能多樣:能增殖成新的Ⅱ型上皮細胞,可以分化為其他細胞如Ⅰ型上皮細胞,能夠合成和分泌表面活性物質(zhì),并具有轉(zhuǎn)運肺內(nèi)體液的功能和強大的免疫功能等。
　　 本課題先檢索1991-2008年來中同大陸有關百草枯中毒的臨床文獻,對文獻中百草枯中毒的流行病學特征進行總結(jié)與分析,從而更好地了解我國百草枯中毒及臨床救治的情況；再以雨草枯和白藜蘆醇為受試物,以大鼠RLE-6TN細胞為研究對象,研究百草枯對肺泡Ⅱ型上皮細胞所造成的氧化損傷,同時探

5、討白藜蘆醇的抗氧化作用能否拈抗百草枯對肺泡Ⅱ型上皮細胞所造成的氧化損傷而起到保護作用,以期能為解決百草枯中毒的難題提供新的依據(jù)。
　　 1 資料與方法
　　 1.11991-2008年我國百草枯中毒文獻分析
　　 以百草枯中毒為主題詞,通過中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(http://dlib.cnki.net/kns50)檢索1991-2008年來國內(nèi)醫(yī)學專業(yè)期刊發(fā)表的有關百草枯中毒的文獻,共獲555篇。經(jīng)逐篇分類與查重,

6、剔除其中非病例性、資料不全及內(nèi)容或作者重復等文獻,最終以369篇文獻作為研究對象,搜集整理相關數(shù)據(jù),分析百草枯中毒病例的一般情況、地區(qū)分布、中毒因為、接觸途徑、治療及轉(zhuǎn)歸等情況。
　　 1.2建立百草枯染毒的細胞模型
　　 以RLE-6TN細胞為受試對象,采用MTT法檢測百草枯染毒后的細胞增殖及細胞毒性改變情況。細胞以1×105個/mL接種于96孔板,培養(yǎng)24 h貼壁后,分別加入終濃度為200 μmol/L,400 μm

7、ol/L,600μmol/L,800μmol/L,1000μmol/L,2000 μmol/L,4000μmol/L的百草枯,對照組則加入等量的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h；終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,棄上清,每孔加入150μL的DMSO,振蕩10 min,使藍色結(jié)晶充分溶解；在波長570nm處,于酶標儀檢測。細胞活性以與對照組相比的百分數(shù)表示,并篩選出百草枯損傷的最佳濃度。
　　 1.3 MTT法檢

8、測細胞經(jīng)白藜蘆醇和百草枯處理后的活性變化
　　 細胞以1×105個/mL接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后分別加入終濃度為0μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L,60 μmol/L,80μmol/L,100μmol/L,120 μmol/L的白藜蘆醇再培養(yǎng)2h,然后分別加入終濃度為1000 μmol/L的百草枯,對照組則同步加入等量的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h；終止培養(yǎng)前4h每孔加入MTT溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,

9、棄上清,每孔加入DMSO 150μL,振蕩10 min,使藍色結(jié)晶充分溶解；于酶標儀在波長570 nm處檢測吸光度值。細胞活性以與對照組相比的百分數(shù)表示。
　　 1.4測定超氧化歧化酶(SOD)活性
　　 細胞分為4組,設1個空白對照組,1個百草枯損傷組(濃度為1000 μmol/L),2個白藜蘆醇保護組(濃度分別為60μmol/L,80 μmol/L)。受試物處理后,均按超氧化歧化酶試劑盒操作進行檢測。
　　

10、1.5測定乳酸脫氫酶(LDH)活性
　　 細胞分為4組,設1個空白對照組,1個百草枯損傷組(濃度為1000 μmol/L),2個白藜蘆醇保護組(濃度分別為60 μmol/L,80 μmol/L)。受試物處理后,按乳酸脫氫酶試劑盒的操作說明進行檢測。
　　 1.6流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡
　　 細胞分為4組,設1個空白對照組,1個百草枯損傷組(濃度為1000 μmol/L),2個白藜蘆醇保護組(濃度分別為6

11、0 μmol/L,80μmol/L)。受試物處理后,按Annexin V-FIFC細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測。
　　 1.7百草枯對RLE-6TN細胞的DNA損傷作用及白藜蘆醇的保護作用
　　 細胞分為4組,設1個空白對照組,1個百草枯損傷組(濃度為1000 μmol/L),2個白藜蘆醇保護組(濃度分別為60μmol/L,80μmol/L)；受試物處理后,進行單細胞凝膠電泳檢測。根據(jù)拖尾細胞占總細胞的比例,來判斷細胞DN

12、A的損傷,并將DNA損傷程度分級。
　　 1.8統(tǒng)計學處理
　　 采用SPSS 13.0版本進行統(tǒng)計學分析,不同濃度百草枯處理后的細胞活性檢測、不同濃度白藜蘆醇處理后的細胞活性檢測、細胞培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶(LDH)活力測定和細胞培養(yǎng)基中的超氧化岐化酶(SOD)活力測定均采用單向方差分析(One-Way ANOVA),并進行多重比較分析,所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,P<0.05有統(tǒng)計學意義。各組DNA損傷程

13、度比較采用多個樣本率比較的卡方檢驗,P<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 2 結(jié)果
　　 2.1我國1991-2008年的百草枯中毒情況
　　 全國各地1991-2008年因口服百草枯中毒及死亡的人數(shù)明顯增加,以河南,四川,山東等省為多；青壯年為主,女性約占2/3。絕大多數(shù)病例為口服自殺。文獻報告總死亡率接近50％。臨床救治主要是減少百草枯吸收、促其排泄及對抗百草枯毒性損傷；及早采用各種血液凈化療法可能有效。

14、　　 2.2百草枯處理后細胞活性的變化
　　 百草枯可損傷細胞,使細胞活性下降,各組的細胞活性隨著百草枯濃度的升高而下降,呈明顯的濃度依賴性；除200 μmol/L組外,其余各組的吸光值與對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 其中 1000μmol/L百草枯組的細胞活性為57.17％,接近LC50,取該濃度造模,作為PQ損傷組。
　　 2.3白藜蘆醇和百草枯處理后的細胞活性改變
　　

15、 先經(jīng)白藜蘆醇的處理,可以增強細胞活性,各濃度白藜蘆醇組的細胞活性均強于百草枯損傷組,尤其是60μmol/L和80 μmol/L白藜蘆醇組(P<0.05)。
　　 2.4細胞培養(yǎng)基中的超氧化歧化酶(SOD)活性變化
　　 百草枯可引起細胞培養(yǎng)基中超氧化歧化酶的下降,各受試組的超氧化歧化酶活力明顯弱于對照組(P<0.05)；而先經(jīng)過白藜蘆醇的處理,可以明顯地使細胞培養(yǎng)基中的超氧化歧化酶升高,60 μmol/L白藜蘆醇組和8

16、0 μmol/L白藜蘆醇組的超氧化歧化酶活力均高于百草枯組(P<0.05)。
　　 2.5細胞培養(yǎng)基中的乳酸脫氧酶(LDH)活性變化
　　 百草枯可引起細胞培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的升高,各受試組乳酸脫氫酶活力明顯強于對照組(P<0.05)；而先經(jīng)過白藜蘆醇的處理,可以有效降低細胞培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶,60 μmol/L白藜蘆醇組和80 μmol/L白藜蘆醇組的乳酸脫氫酶活力均低于百草枯組。
　　 2.6細胞凋亡現(xiàn)象<

17、br>　　 百草枯可引起細胞的凋亡,各受試組的細胞凋亡率均高于對照組；而先經(jīng)白藜蘆醇的處理,可以降低百草枯引起的細胞凋亡,60 μmol/L白藜蘆醇組和80μmol/L白藜蘆醇組的細胞凋亡率均低于百草枯組。
　　 2.7百草枯對RLE-6TN細胞DNA的損傷及白藜蘆醇的保護作用
　　 經(jīng)單細胞凝膠電泳試驗發(fā)現(xiàn),百草枯可造成細胞DNA的損傷,各受試組細胞的拖尾率均高于對照組；而先經(jīng)過白藜蘆醇的處理,可以減輕百草枯所造成的

18、細胞DNA的損傷,60 μmol/L白藜蘆醇組和80 μmol/L白藜蘆醇組的細胞拖尾率均低于百草枯組。
　　 3 結(jié)論
　　 3.1百草枯中毒特別是自服百草枯中毒已成為我國重要的醫(yī)學及社會問題,其中毒人數(shù)呈逐年上升趨勢,中毒死亡率已接近50％,而有效的治療方法尚待探索。
　　 3.21000 μmol/L百草枯可對RLE-6TN細胞造成嚴重的氧化損傷,引起超氧化歧化酶活力下降和乳酸脫氫酶活力的升高,誘導細胞凋亡