OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在肺癌中表達(dá)的定量研究及意義.pdf

1、目的：建立用熒光定量RT—PCR法檢測肺癌組織中人類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（organic anion transporting polypeptide，OATP）B和 D mRNA的表達(dá)，并用免疫組化及圖像分析技術(shù)定量分析肺癌組織中蛋白表達(dá)水平，分析其mRNA及蛋白表達(dá)與病理分型等臨床資料的關(guān)系。 方法： 1.熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及優(yōu)化： （1）組織總RNA提?。河肨iozol試劑分別提取不同病理分型肺癌組

2、織和正常肺組織中的總RNA。 （2）cDNA的合成：以所提取的組織的總RNA為原料進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。 （3）PCR反應(yīng)及重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收法進(jìn)行純化。用PGEM—T Easy質(zhì)粒載體連接PCR純化產(chǎn)物，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒。 （4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及優(yōu)化：優(yōu)化熒光定量PC

3、R體系和條件，以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品建立檢測OATP mRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以此對40例肺癌標(biāo)本中OATP—B和OATP—D mRNA的含量進(jìn)行測定。 2.免疫組化：采用鏈霉親和素—過氧化酶法（S—P法），DAB顯色液顯色，以抗OATP—B和抗OATP—D為一抗，PBS作為陰性對照，鑒定肺癌中OATP—B和OATP—D蛋白的表達(dá)。用IPP4.0圖像分析軟件對免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析。 3.臨床資料分析：結(jié)合臨床資料，分析OATP

4、—B和OATP—D的mRNA及蛋白表達(dá)與病理分型、性別、年齡、腫瘤大小以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的關(guān)系。 4.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件包對所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用X±S表示，多組均數(shù)間的比較采用方差分析，多組均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：構(gòu)建了OATP基因的重組質(zhì)粒，并且成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選提取重組質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，以

5、稀釋的質(zhì)粒為模板優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件，建立定量檢測OATP—B和OATP—D mRNA的最佳熒光定量PCR體系。熒光定量PCR結(jié)果顯示，OATP—B和OATP—D的mRNA在不同病理分型肺癌中表達(dá)上調(diào)，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；OATP—B和OATP—D的mRNA在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。免疫組化法顯示，與正常肺組織相比，OATP—B和OATP—D蛋白在不同病理分型肺癌中高表達(dá)，P<0.0

6、5，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；OATP—B和OATP—D蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌中的表達(dá)明顯無高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。OATP—B和OATP—D的mRNA及其蛋白在不同病理分型、性別、年齡及不同大小肺癌標(biāo)本間的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，P>0.05。 結(jié)論： 1.建立并優(yōu)化檢測OATP—B和OATP—DmRNA表達(dá)的熒光定量PCR體系。2.OATP—B和OATP—D的mRNA及其蛋白在不同病理分型肺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)