血根堿引起的藥物—藥物相互作用及抗惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、背景:血根堿是一種具有抗微生物、抗炎等多種生物學(xué)活性的生物堿，因其對多種人類腫瘤細胞系有較強的抑制作用而被推薦為抗癌候選藥物。鑒于對中藥單體的毒性和藥效活性評價是其成藥的兩大前提因素，因此本研究擬對血根堿的毒性和抗癌活性進行深入的探討。藥物的毒副作用已經(jīng)被大量文獻報道，其產(chǎn)生毒性存在種屬差異。血根堿對細胞色素P450酶的抑制與其毒性相關(guān)。惡性黑素瘤是高度惡性皮膚腫瘤，可發(fā)生早期血行轉(zhuǎn)移，腦和肺等是其主要侵襲、轉(zhuǎn)移器官，該類疾病手術(shù)治療困

2、難，且預(yù)后極差。惡性黑素瘤惡性程度高、轉(zhuǎn)移發(fā)生早。理想的抗惡性黑素瘤的藥物最好既能有效的抑制原發(fā)腫瘤的增殖，又能抑制其轉(zhuǎn)移。目前用于抗腫瘤藥物篩選的體外模型主要是平面培養(yǎng)，即二維模型。細胞二維培養(yǎng)模型存在一些缺陷:缺乏真實的腫瘤組織的微環(huán)境，缺少細胞外基質(zhì)的支持，腫瘤細胞的貼壁生長使其喪失了某些生物學(xué)特性。
　　目的:
　　1.研究血根堿是否會誘發(fā)經(jīng)CYP酶抑制的藥物-藥物相互作用。
　　2.研究血根堿是否能夠抑制人惡

3、性黑色素瘤細胞株451LU的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移能力。
　　3.建立一種人惡性黑色素瘤細胞株451LU的三維培養(yǎng)模型，對其形態(tài)學(xué)及功能學(xué)進行初步評價，并在此基礎(chǔ)上對血根堿的抗腫瘤活性再次進行評價。
　　方法:
　　1.通過CYP探針底物反應(yīng)，對血根堿對CYP酶各個亞型的抑制能力進行評價，繼而通過單點失活實驗、抑制動力學(xué)實驗進行可逆和基于時間依賴的抑制動力學(xué)參數(shù)測定，根據(jù)FDA推薦的預(yù)測公式推導(dǎo)出體內(nèi)血根堿藥物-藥物相互作用

4、程度的預(yù)測。
　　2.用SRB法檢測不同濃度血根堿對惡性黑素瘤細胞細胞活力的影響，通過Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細胞術(shù)檢測目標(biāo)濃度血根堿對惡性黑色素瘤細胞細胞活力的影響。通過transwell腫瘤細胞侵襲實驗、細胞傷口愈合實驗、基質(zhì)-細胞粘附實驗、內(nèi)皮細胞增殖實驗來檢測血根堿對惡性黑色素瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、粘附及對內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用。通過realtimePCR，Westernblot來檢測腫瘤轉(zhuǎn)移、粘附、血管生成相關(guān)基因和

5、蛋白的影響。WesternBlot法檢測血根堿對惡性黑索瘤細胞的FAK信號通路的影響。
　　3.將人惡性黑色素瘤細胞株451LU種植于鼠尾膠原中，使細胞在三維立體條件下生長。通過組織學(xué)染色、細胞活性分析及免疫熒光染色對細胞的形態(tài)學(xué)進行評價，通過DNA含量的測定來反映不同培養(yǎng)條件下細胞增殖的情況，通過realtimePCR檢測相關(guān)基因表達量的差異。通過MTT法評價四種抗癌藥物對惡性黑素瘤細胞的細胞活力的影響。
　　結(jié)果:

6、>　　1.對血根堿是否會引經(jīng)CYP酶抑制的藥物-藥物相互作用進行研究
　　首先考察80μM血根堿對CYP各個亞型催化的探針反應(yīng)的抑制作用，結(jié)果顯示對于CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4，血根堿對其活性的抑制超過50％，進一步對其抑制的半數(shù)抑制濃度(IC50)進行測定。血根堿對其催化的反應(yīng)產(chǎn)生濃度依賴型的抑制，IC50值分別為4.5、10.2、7.2和3.4μM。選擇不同血根堿濃度和探針底物濃度對抑制CYP1A2

7、，CYP2C8，CYP2C9，CYP34的可逆抑制類型和抑制動力學(xué)參數(shù)進行了測定。用Lineweaver-Burk作圖方法來判斷可逆抑制類型，用二次作圖來計算抑制動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，血根堿對CYP1A2，CYP3A4和CYP2C9的抑制類型屬于競爭性抑制，而對CYP2C8屬于非競爭性抑制。用Lineweaver-Burk作圖中的每條線的斜率對血根堿濃度作圖，求得可逆抑制常數(shù)Ki，CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4K

8、i值分別為2.7、8.9、3.8和2.0μM。在單點失活實驗中，加入NADPH預(yù)孵后的血根堿對CYP1A2、CYP3A4活性的抑制百分比分別增加了25.5％和20.3％，對其它CYP亞型的抑制增加的百分比均小于15％。研究發(fā)現(xiàn)，血根堿對CYP1A2，CYP3A4催化的反應(yīng)體現(xiàn)出時間依賴和NADPH依賴的抑制行為。其對兩酶的TDI抑制動力學(xué)參數(shù)K(l)/kinactvalues分別為13.3/0.087和5.58/0.029min-1μM

9、-1.
　　2.研究血根堿是否能夠抑制人惡性黑色素瘤細胞株451LU的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移能力
　　0.02-50μM血根堿可以顯著抑制人惡性黑素瘤451-LU細胞的細胞活力，為避免細胞活力因素對后續(xù)實驗的影響，分別選擇安全濃度、低毒濃度和80％細胞活力的三個濃度，即1μM、1.5μM、2μM三個濃度用于后續(xù)實驗。AnnexinⅤ和PI雙染流式細胞術(shù)可見1-2μM血根堿對451-LU細胞活力無明顯的影響。1-2μM血根堿對451

10、-LU細胞粘附能力均有一定的抑制作用。可以抑制451-LU細胞與基質(zhì)膠原的粘附作用，且抑制能力呈時間、濃度依賴性。血根堿可以抑制451-LU細胞侵襲、遷移的能力，但各組間未見顯著差異。通過SRB方法檢測血根堿對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示，nM級別的血根堿可對人臍靜脈內(nèi)皮細胞出現(xiàn)較強的抑制作用。分別選取與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的三組蛋白，MMP-2、MMP-2、ICAM-1、VCAM-1、EGF和VEGF-A，將原位惡性黑素瘤WM35

11、與轉(zhuǎn)移株451LU細胞中各蛋白mRNA的表達情況通過realtime-PCR的手段進行檢測，結(jié)果顯示ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A的mRNA表達存存顯著的增加。1-2μM血根堿均可以抑制ICAM-1，MMP-2，EGF和VEGF-A的mRNA表達。血根堿同樣可以抑制ICAM-1，MMP-2蛋白的表達，可以下調(diào)FAK及P-FAK的表達。
　　3.人惡性黑素瘤細胞株451LU三維培養(yǎng)模型
　　傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)中，3

12、天左右細胞出現(xiàn)增殖，5天左右開始出現(xiàn)凋亡，到第7天已經(jīng)大部分凋亡，而三維培養(yǎng)條件下，451LU細胞呈腫瘤團狀增殖，至14天仍可見良好細胞活性。與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)條件下的細胞增殖能力顯著增加。顯微鏡下可見細胞呈球團狀生長，晚期（14天）腫瘤團中央可出現(xiàn)缺氧壞死，與在體腫瘤類似。使用MTT的方法對二維培養(yǎng)條件和三維培養(yǎng)條件下阿霉素、長春堿、紫杉醇和血根堿的抗451LU活性進行檢測，在三維培養(yǎng)條件下，阿霉索、長春堿和血根堿各組的I

13、C50值存在不同程度的提升，而紫杉醇組仍舊未檢測到抗癌活性。在三維培養(yǎng)條件下，分別選取在二維培養(yǎng)條件下出現(xiàn)顯著差異的ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A，及其在惡性黑素瘤中存在高表達的WT1、BRAF-V600E，與藥物吸收相關(guān)的P-gp，與腫瘤細胞脫落相關(guān)的KLK7，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在三維培養(yǎng)條件下，MMP2、ICAM-1、BRAF-V600E、p-gp的mRNA表達出現(xiàn)顯著的增加。
　　結(jié)論:
　　1.血根堿對C

14、YP1A2、CYP3A4和CYP2C9產(chǎn)生了競爭性的可逆抑制作用，對CYP2C8產(chǎn)生了非競爭性的可逆抑制作用。血根堿還對CYP1A2和CYP3A4產(chǎn)生了時間依賴性的抑制。血根堿與CYP1A2、CYP3A4、CYP2C8和CYP2C9的底物共用時可能誘發(fā)嚴(yán)重藥物-藥物相互作用。
　　2.血根堿可以顯著抑制人惡性黑素瘤451LU細胞增殖能力。同時，血根堿可抑制黑素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成的能力，其抑制侵襲轉(zhuǎn)移的能力可能與下調(diào)MMP2、I