低糖基化E-Cadherins抑制舌癌細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)理研究.pdf

1、目的:
　　研究表明腫瘤細(xì)胞中E-cadherin胞外域發(fā)生高度異常N-糖基化，抑制腫瘤細(xì)胞之間形成成熟的黏附連接，使腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲能力增強(qiáng)。本課題通過基因轉(zhuǎn)染提高腫瘤細(xì)胞連接的穩(wěn)定性來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其可能會(huì)成為腫瘤基因治療的新思路。本課題的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^低糖基化的E-cadherin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Ca127舌癌細(xì)胞研究轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲的影響及其發(fā)生機(jī)制。
　　方法:
　　1.用編碼有Fla

2、g標(biāo)簽的低糖基化E-cadherin(V13)和野生型E-cadherin(E-cad)的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Ca127細(xì)胞。通過G418篩選獲得轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，使用Westernblot檢測(cè)外源性E-cadherin的表達(dá)。
　　2.通過CCK-8實(shí)驗(yàn)獲得各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)不同組細(xì)胞的增殖能力。
　　3.通過單層細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞遷移能力。
　　4.通過細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力。
　　5.使

3、用免疫沉淀法檢測(cè)E-cadherins介導(dǎo)的AJs(adherensjunctions)復(fù)合體中的α-catenin、β-catenin、γ-catenin和vinculin的含量。
　　6.通過細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.Westernblot結(jié)果顯示:外源性編碼E-cadherin的基因都有顯著表達(dá)，低糖基化E-cadherin的分子量比野生型E-cadher

4、in的分子量要小。
　　2.CCK-8結(jié)果顯示:72h后，相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞和野生型E-cadherin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，低糖基化E-cadherin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD值明顯降低，差異具有顯著性。
　　3.單層細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與野生型轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，低糖基化組細(xì)胞的劃痕關(guān)閉速度明顯減慢，差異顯著。
　　4.體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:低糖基化組細(xì)胞侵襲能力比野生型轉(zhuǎn)染細(xì)胞小，野生型轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比未轉(zhuǎn)染組侵襲能力降低

5、，差異顯著。
　　5.免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與野生型轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，低糖基化組細(xì)胞的胞內(nèi)域有更多的α-catenin、β-catenin、γ-catenin和vinculin與其相連接，黏附連接更穩(wěn)定，兩者之間的差異具有顯著性。
　　6.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:對(duì)照組中E-cadherin彌散性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，野生型組細(xì)胞E-cadherin在細(xì)胞膜有部分集中性表達(dá)，但是表達(dá)不連續(xù)，低糖基化組細(xì)胞中E-cadherin在細(xì)胞膜