花生抗黃曲霉iso-ARah3基因的克隆及功能研究.pdf

1、黃曲霉毒素是由真菌類的黃曲霉和寄生曲霉侵染易感宿主后產(chǎn)生的一類真菌毒素，普遍存在于土壤、農(nóng)作物及各種食品中，進而危害動物和人類的生命健康，被認為是最嚴重的食品安全問題之一?；ㄉ鞘茳S曲霉菌侵染和黃曲霉毒素危害最為嚴重的作物，已成為全球花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素。目前，國內(nèi)外學(xué)者普遍認為解決花生黃曲霉毒素的污染最經(jīng)濟有效的可行途徑是通過基因工程手段培育抗性品種。通過研究花生抗黃曲霉機制，挖掘抗性相關(guān)基因和標記，利用基因工程技術(shù)培育農(nóng)藝性狀

2、優(yōu)良的抗性花生新品種。本研究室前期通過差異蛋白質(zhì)組和基因組研究發(fā)現(xiàn)，收獲前干旱脅迫及黃曲霉侵染下，抗-感黃曲霉花生資源間存在一些差異表達基因，其中iso-ARah3基因在干旱及黃曲霉脅迫下誘導(dǎo)表達差異最顯著，推測其在花生抗黃曲霉反應(yīng)中有重要作用，對其直接的分子功能及抗黃曲霉反應(yīng)中作用機制的研究尚未見報道。
　　在前期的研究基礎(chǔ)上，本論文：1)通過表達基因芯片對抗（Y20）-感（H23）花生品種進行誘導(dǎo)差異分析，篩選出1-2個顯著響

3、應(yīng)黃曲霉相關(guān)基因，對其進行熒光定量PCR檢測和時空表達特性分析；2）通過PCR克隆獲得iso-ARah3基因全長，進行生物信息學(xué)分析；構(gòu)建原核表達載體，進行融合蛋白質(zhì)的體外表達與純化；通過免疫兔子，制備多克隆抗體，并對iso-ARah3蛋白質(zhì)的組織表達進行WesternBlot檢測；3）通過克隆將iso-ARah3基因轉(zhuǎn)入植物超表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將含有iso-ARah3基因的陽性載體轉(zhuǎn)化到花生中進行體內(nèi)超表達分析；4）利用基因組

4、步行技術(shù)從花生基因組DNA中克隆iso-ARah3基因上游啟動子序列，并進行生物信息學(xué)分析。
　　主要獲得以下研究結(jié)果：
　　1.利用表達基因芯片技術(shù)，比較抗-感花生品種在收獲前干旱及黃曲霉處理條件下基因表達差異，發(fā)現(xiàn)抗性品種（Y20）中iso-ARah3基因在干旱及黃曲霉脅脅迫處理下表達量顯著上調(diào)，結(jié)果證明花生iso-ARah3基因在某種程度上參與了抗性品種抗黃曲霉侵染。采用熒光定量PCR進行時空、組織誘導(dǎo)表達分析，得出該

5、基因表達水平隨著種子的不同發(fā)育時期有所不同，在種子剛剛發(fā)育時其表達量最高。在花生的不同組織中，該基因的表達量也不相同，分別對花生葉、根、花蕾、花、莖中該基因的表達量進行測定，該基因在在花中沒有表達，在葉、花蕾中的表達量相同，莖中的表達量是葉、花蕾中的6倍，在根中該基因具有很高的表達量是葉、花蕾中表達量的200多倍。該基因在受到不同病害脅迫下，表達的模式也不相同。在受到銹病感染時，其表達量為零。與正常葉片相比，受到葉斑病侵染，其表達量上調(diào)

6、，受到花葉病侵染條件下，該基因的表達量上調(diào)最為顯著。
　　2.以cDNA為模板，通過PCR技術(shù)克隆該基因全長，生物學(xué)信息學(xué)分析表明，該基因具有1531bp的開放讀碼框，編碼510個氨基酸。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該蛋白含有8個α-螺旋和22個β-折疊，序列含有2個Cpuin-1的相對保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域，屬于cupin蛋白超家族。通過同源序列比對，表明測序所獲得基因序列與NCBI公布的序列有兩處堿基序列不同，構(gòu)建pET28a-isoARah3原

7、核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達后經(jīng)鎳柱親和層析，獲得大小約為54kD的原核表達融合蛋白。對其體外功能研究表明，融合蛋白具有體外抑菌的功能，但作用效果不是很明顯?？贵w制備經(jīng)WesternBlot檢測制備成功，且純度為84.5％。以含iso-ARah3基因的抗體為一抗，對花生種子、胚、和子葉時期的總蛋白進行蛋白免疫印跡雜交試驗，花生種子、胚、子葉均在相應(yīng)位置出現(xiàn)了雜交信號，且花生種子出現(xiàn)的條帶豐度最高，在翻譯的水平進一步檢測了iso-

8、ARah3基因的表達。
　　3.以PCAMBIA1301為雙元表達載體，通過雙酶切分別插入啟動子35S和目的基因iso-ARah3，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化，侵染植物種子后進行該基因的植物表達。獲得花生植株后，提取植株的DNA，經(jīng)潮霉素抗性篩選結(jié)果表明獲得了7株擬轉(zhuǎn)基因花生植株。為進一步了解iso-ARah3基因的在花生中的功能及調(diào)控表達機制的研究提供了基礎(chǔ)。
　　4.以酶切構(gòu)建的DNA庫為模板，利用巢式PCR法成功克隆