利用密度感應(yīng)抑制技術(shù)控制水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性病害的基礎(chǔ)研究.pdf

1、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是全球食物生產(chǎn)增長最快的系統(tǒng)之一,但是病害頻發(fā)阻礙了其進(jìn)一步健康地發(fā)展。目前,抗生素是公認(rèn)的治療細(xì)菌性疾病的有效方法。抗生素的濫用使藥物殘留問題嚴(yán)重,并進(jìn)一步加快了細(xì)菌抗藥性的出現(xiàn)。密度感應(yīng)(quorum sensing, QS)是微生物之間的一種交流機(jī)制,用于調(diào)控基因的表達(dá)以及協(xié)調(diào)微生物的群體性行為,如生物被膜的形成、生物發(fā)光和毒力因子的分泌等。研究發(fā)現(xiàn)在多種致病菌中,致病因子的分泌和QS密切相關(guān)?？股氐臑E用使得細(xì)菌抗藥性

2、問題越來越嚴(yán)重。由于QS不是微生物生存所必需的,因此淬滅致病菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorum quenching, QQ)可以在不殺死細(xì)菌的情況下大大地降低其毒力因子的表達(dá),同時降低環(huán)境中的選擇壓力和出現(xiàn)細(xì)菌抗藥性的幾率,因此密度感應(yīng)淬滅技術(shù)是一種極具開發(fā)前景的細(xì)菌性病害的控制手段。相關(guān)研究表明海洋中蘊(yùn)含著豐富的QQ酶資源,而目前發(fā)現(xiàn)的QQ活性物質(zhì)特別是QQ酶主要來源于陸地微生物。本論文建立了一種高通量的QQ菌株篩選方法,從牙鲆體內(nèi)及養(yǎng)殖

3、環(huán)境中分離篩選土著 QQ菌株,對具有強(qiáng) QQ活性的耐油具柄菌(Muricauda olearia)Th120的QQ活性物質(zhì)進(jìn)行了鑒定,并完成了該菌株的全基因組測序及分析。本論文研究結(jié)果可為發(fā)展以密度感應(yīng)淬滅技術(shù)為基礎(chǔ)的、健康可持續(xù)發(fā)展的水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的預(yù)防和控制手段提供理論基礎(chǔ)。
　　為了能從數(shù)量龐大的海洋微生物中快速鑒定QQ細(xì)菌,本論文建立了一種簡單快速的 QQ菌株高通量篩選方法。該方法采用的 AHL報告菌根癌農(nóng)桿菌(Agr

4、obacterium tumefaciens)對AHL分子具有高靈敏度的檢測能力,為達(dá)到高通量篩選的目的,在檢測方法上主要有兩個關(guān)鍵步驟:一方面通過標(biāo)準(zhǔn)化檢測吸光度值,消除報告菌細(xì)胞的影響,從而大大提高了檢測的準(zhǔn)確度并實現(xiàn)β-半乳糖苷酶活性的定量檢測;另一方面通過使用緩沖液PIPES,有效地排除了因pH值過高而導(dǎo)致的假陽性QQ菌株。該方法能同時對大批量的待測菌株進(jìn)行高效地篩選。利用該方法從分離自健康牙鲆腸道、鰓、粘液以及養(yǎng)殖環(huán)境的366

5、株土著菌中篩選到了25株QQ細(xì)菌。這些QQ細(xì)菌分別屬于黃桿菌綱、α變形菌綱以及γ變形菌綱的14個種,其中12個種的細(xì)菌其AHL降解活性為首次報道。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),這些QQ細(xì)菌的AHL降解特性各不相同,部分菌株的AHL降解活性被證明是內(nèi)酯酶活性。具強(qiáng)QQ活性的海黏奧雷氏菌(Olleya marilimosa)T168、居珊瑚假交替單胞菌(Pseudoalteromonas prydzensis)Th125以及耐油具柄菌(M. oleari

6、a)Th120能夠提高斑馬魚抗嗜水氣單胞菌侵染的能力,表明其具有進(jìn)一步開發(fā)為水產(chǎn)養(yǎng)殖有益菌的潛力。
　　對強(qiáng)QQ活性菌株耐油具柄菌Th120的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),該菌株可能同時具有QQ酶和QS小分子阻抑物。利用膠內(nèi)QQ活性檢測、蛋白質(zhì)譜檢測以及全基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)菌株Th120的5個蛋白具AHL降解活性。包括一個AHL內(nèi)酯酶及一個AHL?；D(zhuǎn)移酶,分別將其命名為MomL(Muricauda olearia marine lactona

7、se)和MomA(M. olearia marine acylase)。在已鑒定的AHL內(nèi)酯酶中, MomL與AiiA的氨基酸序列相似度最高(一致性為28.85％)。MomL具有信號肽序列,是目前金屬-β-內(nèi)酰胺酶家族中唯一一個分泌到胞外的 AHL內(nèi)酯酶。MomL具有高效的AHL降解活性,對C6-HSL的降解效率是AiiA的10倍左右,能降解不同碳鏈長度(C4-C14)的 AHL分子,對長鏈以及3號碳位帶羰基的AHL分子具有更高的降解效

8、率。MomL的最適反應(yīng)溫度為40°C,經(jīng)60°C處理30 min后,保留32%的活性。MomL是一種金屬蛋白,對Mg2+的親和性高,但是不易結(jié)合Co2+,推測Be2+可促進(jìn)其AHL降解活性,而AiiA的結(jié)合金屬主要是Zn2+。定點突變研究發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基位點His117,His119,Asp121,His122, His189和His214對其AHL降解活性是必需的。BLAST檢索發(fā)現(xiàn)MomL的同源蛋白主要分布于海洋黃桿菌科細(xì)菌中,因此M

9、omL的分泌特性、AHL降解機(jī)制以及活性位點等結(jié)果均表明其代表一類新型海洋AHL內(nèi)酯酶。重組MomL能夠有效抑制銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白酶的分泌以及綠膿菌素的產(chǎn)生,表明其具有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的潛力。
　　采用 Illumina高通量測序技術(shù)對 Th120的全基因組進(jìn)行了測序及分析,經(jīng)RAST服務(wù)器分析后共得到17條contigs和11條scaffolds序列,測得的基因組大小為3.94 M

10、bp,G+C含量為43.86%。共預(yù)測到3730個基因。通過COG,KEGG等數(shù)據(jù)庫對菌株 Th120基因組的注釋分析發(fā)現(xiàn),相比于其他代表性的海洋黃桿菌科細(xì)菌,菌株 Th120中參與糖類轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝以及防御機(jī)制等生物過程的基因比例較高。其中鐵元素代謝相關(guān)的基因尤其豐富,Th120含有22個鐵運(yùn)輸相關(guān)的基因,其中5個為鐵載體受體蛋白編碼基因。菌株Th120中主要由SufABCDSE組成的SUF系統(tǒng)來合成

11、Fe-S簇,而MomL的編碼基因處于suf操縱子之內(nèi);由于MomL的活性受Fe2+的抑制作用,因此推測MomL可能參與調(diào)控Fe-S簇的合成。此外,通過本地BLAST檢索預(yù)測到一個N-酰基氨基酸水解酶,可能具有降解N-?；呓z氨酸(MomL降解AHL的產(chǎn)物)的活性。本論文篩選到的QQ細(xì)菌中,海黏奧雷氏菌T168、鰨魚附著桿菌(Tenacibaculum soleae)T133和異色附著桿菌(T. discolor)T84都屬于黃桿菌科細(xì)菌

12、,其中菌株T168和T133的AHL降解活性被證明為內(nèi)酯酶活性,但是這三種細(xì)菌的QQ酶編碼基因還未得到鑒定。以AHL降解酶MomL和MomA的氨基酸序列為基礎(chǔ),結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫中的附著桿菌屬以及奧雷氏菌屬的細(xì)菌的全基因組序列,預(yù)測發(fā)現(xiàn)海黏奧雷氏菌、鰨魚附著桿菌和異色附著桿菌可能都具有MomL的同源蛋白,而鰨魚附著桿菌和異色附著桿菌同時具有MomA的同源蛋白。
　　綜上所述,本論文建立了一種QQ菌株的高通量篩選方法,用這種方法篩選