桑葚縮小型菌核病病原學(xué)及其分子檢測(cè)體系.pdf

1、桑葚菌核病是重要的果桑病害，并且是制約果桑產(chǎn)業(yè)的重大障礙。通過(guò)表現(xiàn)的癥狀可以將桑葚菌核病分為三種:肥大、縮小和小粒型。桑實(shí)杯盤(pán)菌、肉阜狀杯盤(pán)菌和核地杖菌被認(rèn)為是引起桑葚菌核病的病原。但是，病原菌和病害類(lèi)型之間的關(guān)系尚不清楚，且缺乏病原菌形態(tài)學(xué)和生物學(xué)方面的信息。仍然沒(méi)有一種分子方法來(lái)檢測(cè)病原菌和診斷病害。在本試驗(yàn)中，鑒定了桑葚縮小型菌核病菌，并研究了其生物學(xué)特性。利用SCAR-PCR建立了一個(gè)檢測(cè)桑葚縮小型菌核病菌的分子檢測(cè)系統(tǒng)。

2、>　　1、桑葚縮小型菌核病菌的分離和鑒定:對(duì)2012-2014年采集的247個(gè)樣品進(jìn)行病原菌的分離。用組織分離法和孢子萌發(fā)法均沒(méi)有獲得真菌純培養(yǎng)。用保濕培養(yǎng)法從25個(gè)桑病果樣品中分離到5個(gè)純的病原菌，分離率為20％。赫氏證病法證明，所獲得5株真菌均為病原菌。通過(guò)結(jié)合采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，以及致病性測(cè)試確定分離出的病原菌菌株均為引起桑葚縮小型菌核病的核地杖菌(Scleromitrula shiraiana)。
　　2、

3、核地杖菌的形態(tài)學(xué)特征:在單個(gè)菌核上長(zhǎng)出1至數(shù)個(gè)子實(shí)體，子實(shí)體有長(zhǎng)柄，柄部扁平稍扭曲，灰褐色，長(zhǎng)有茸毛。子實(shí)體的頭部為紡錘形，有若干條縱行褶皺。子囊生于頭部外面的子實(shí)層中，大小為4-6μm×53-68μm，內(nèi)含8個(gè)子囊孢子。子囊孢子呈橢圓形，一端略尖，無(wú)色透明，大小2.3-4.2μm×4.8-9.7μm。其分生孢子梗細(xì)絲狀具分枝，端生卵至橢圓形、無(wú)色單胞型分生孢子。SS1-SS5菌落都呈灰白色，邊緣不規(guī)則，后期在菌落表面形成粘稠狀的小孢子

4、堆，病原菌接觸的培養(yǎng)基表面形成堅(jiān)硬的一層不明物質(zhì)。小孢子短橢圓形，單孢，大小1.8-2.2μm×4.3-4.9μm。
　　3、核地杖菌的生物學(xué)特性:測(cè)試了8種培養(yǎng)基，核地杖菌的最適培養(yǎng)基為綠豆培養(yǎng)基和桑葉培養(yǎng)基，病原菌在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度非常緩慢，10d菌落直徑僅能達(dá)到37.68 mm。核地杖菌生長(zhǎng)適宜的溫度為5-35℃，最適溫度為25℃。核地杖菌在pH4-11的MBDA培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，最適酸度為pH7.0。在供試的7種碳

5、源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖、菊糖和甘露醇）中，核地杖菌對(duì)葡萄糖和甘露醇利用最好。在供試的7種氮源中，核地杖菌對(duì)胰蛋白胨利用最好，在以硝酸鉀、硝酸銨和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)相對(duì)正常，磷酸銨和硫酸銨對(duì)核地杖菌的生長(zhǎng)有輕微的抑制作用。
　　4、核地杖菌對(duì)殺菌劑的敏感性:試驗(yàn)選用了7種常用殺菌劑（85％戊唑醇、5％井岡霉素、25％咪鮮胺、70％甲基硫菌靈、10％苯醚甲環(huán)唑、40％菌核凈和1％武夷菌素），分別以不同濃度加入到M

6、BDA培養(yǎng)基中。結(jié)果顯示它們的EC50分別為0.0132μg/mL、0.1516μg/mL、0.1809μg/mL、0.2028μg/mL、0.7867μg/mL、1.4634μg/mL和5.3400μg/mL，以戊唑醇對(duì)核地杖菌抑制作用最強(qiáng)。
　　5、核地杖菌的分子檢測(cè)體系的建立:本試驗(yàn)利用SCAR-PCR成功建立了一個(gè)分子檢測(cè)系統(tǒng)用于核地杖菌的檢測(cè)。
　　(1)RAPD特異引物的篩選。利用RAPD技術(shù)，用40條隨機(jī)引物擴(kuò)

7、增核地杖菌，篩選出4條條帶清晰且穩(wěn)定擴(kuò)增的隨機(jī)引物用于擴(kuò)增供試菌株篩選特異隨機(jī)引物，4條隨機(jī)引物中，只有CS23能夠在核地杖菌中產(chǎn)生兩條特異性的條帶。因此，CS23(5'-CGCAGCCGAGAT-3')是核地杖菌特異的隨機(jī)引物。
　　(2)SCAR特異引物的篩選:將這兩條特異性的條帶回收和測(cè)序用于特異性SCAR引物的篩選，從中設(shè)計(jì)了20對(duì)引物，篩選出一條理想的SCAR引物對(duì)SS-F/SS-R，上游引物為5'-AGTAAAGAGA

8、ACATCAAACTTCG-3'，下游引物為5'-ACTTCCACCGACCAATCT-3'。
　　(3)檢測(cè)體系的優(yōu)化:通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系中退火溫度及各個(gè)組分(Mg2+、dNTPs、引物和rTaq酶)的濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到一個(gè)優(yōu)化的擴(kuò)增體系。優(yōu)化的擴(kuò)增體系為:2.5μL10× PCR Buffer;2.25μL Mg2+(25 mmol/L);2.5μL dNTPs(2.5 mmol/L);0.625μL引物SS-F/SS-R(

9、10μmol/L);1μL模板(10 ng/μL);0.2 U rTaq酶;ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94C變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次;72℃補(bǔ)充延伸5 min。
　　(4)檢測(cè)體系的特異性驗(yàn)證:利用引物對(duì)SS-F/SS-R和優(yōu)化的檢測(cè)體系擴(kuò)增10個(gè)相關(guān)菌株的基因組DNA。結(jié)果表明:所有的核地杖菌菌株都擴(kuò)增出了一條590 bp的條帶，而其它9種真菌沒(méi)有擴(kuò)增出

10、條帶。也就是說(shuō)，只有核地杖菌呈陽(yáng)性反應(yīng)。因此，建立的SCAR-PCR系統(tǒng)可以特異的檢測(cè)核地杖菌。
　　(5)檢測(cè)體系的靈敏度檢測(cè):將核地杖菌的基因組DNA從10 ng/μL開(kāi)始依次10倍稀釋至1fg/μL，得到不同的DNA濃度(10 ng，1 ng，100 pg，10 pg，1 pg，100fg，10fg and1 fg/μL)，各濃度取1μL為模板利用優(yōu)化的體系進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，特異的條帶能從濃度為1 pg/μL及以上濃度擴(kuò)增

11、出來(lái)，表明該檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)于檢測(cè)核地杖菌是非常靈敏的。
　　6、SCAR-PCR檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用:試驗(yàn)建立的SCAR-PCR檢測(cè)系統(tǒng)可以用于接種桑葚和田間樣品的檢測(cè)以及桑葚縮小型菌核病的診斷。
　　(1)接菌桑葚的快速檢測(cè):于2月下旬將桑樹(shù)枝用硫酸紙袋套袋，套袋后待雌花柱頭剛開(kāi)始膨大時(shí)進(jìn)行接種試驗(yàn)。用檢測(cè)體系對(duì)2-5 d采集的桑葚樣品(未顯癥)DNA和第30 d采集的桑葚（顯癥）以及健康桑葚DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，檢測(cè)體系

12、可以從接種2d及之后的桑葚中檢測(cè)出病原菌的存在，而沒(méi)有接種的樣品則檢測(cè)不出。表明建立的檢測(cè)系統(tǒng)用于檢測(cè)核地杖菌是可靠的，此檢測(cè)體系可用于桑葚縮小型菌核病的早期檢測(cè)。
　　(2)檢測(cè)體系的田間檢測(cè):試驗(yàn)檢測(cè)2個(gè)花期桑葚、3個(gè)不同發(fā)病形態(tài)的病果、1個(gè)桑樹(shù)根、2個(gè)桑樹(shù)莖、2個(gè)桑樹(shù)葉和12份隨機(jī)采集的土樣，結(jié)果顯示，在這些樣品中，只有癥狀為縮小的病果呈陽(yáng)性，而其它樣品呈陰性。表明試驗(yàn)建立的檢測(cè)體系在桑田范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確的鑒定和檢測(cè)桑葚縮小型

13、菌核病菌。
　　(3)檢測(cè)體系用于病害診斷:通過(guò)人工將從田間采集的病樣分為8個(gè)縮小狀和8個(gè)腫大狀的樣品，用檢測(cè)系統(tǒng)擴(kuò)增這些樣品DNA。結(jié)果顯示5個(gè)縮小狀和1個(gè)腫大狀的樣品呈陽(yáng)性，而其它樣品呈陰性。顯示出人工診斷和分子診斷結(jié)果不一樣，表明SCAR-PCR診斷更準(zhǔn)確、可靠和實(shí)用。
　　最后，桑葚縮小型菌核病是由核地杖菌引起。成功建立一個(gè)SCRA-PCR檢測(cè)系統(tǒng)并測(cè)試了接種的樣品和田間樣品。該檢測(cè)系統(tǒng)非常特異、靈敏、可靠和準(zhǔn)確。這