胃旁路轉(zhuǎn)流術(shù)對(duì)Goto-Kakizaki大鼠肝臟胰島素抵抗調(diào)控的研究.pdf

1、目的：
　　2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)是由環(huán)境、基因及內(nèi)分泌等因素引起的一種病理狀態(tài)。全球的患病數(shù)量及對(duì)于T2DM科研和治療上的花費(fèi)正逐步加大，中國(guó)的T2DM患者占總?cè)丝诒壤呀咏?0％，成為威脅國(guó)人健康的第一大疾病。T2DM可引起多系統(tǒng)損害，如冠心病、缺血性或出血性腦血管疾病、腎動(dòng)脈硬化、肢體動(dòng)脈硬化閉塞癥，多年來(lái)對(duì)于T2DM的臨床治療一直采用傳統(tǒng)的保守治療，但藥物治療和胰島素替代療法

2、不能延緩T2DM患者并發(fā)癥的出現(xiàn)及改善預(yù)后。
　　近些年來(lái)，減肥外科醫(yī)生進(jìn)行減肥手術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn):接受胃旁路(Roux-en-Y gastricbypass，RYGB)手術(shù)的合并T2DM的肥胖病人，術(shù)后血糖降至正常，并能長(zhǎng)期維持，但其作用機(jī)理目前仍未完全清楚。目前研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)的脂肪組織不僅是一個(gè)被動(dòng)的能量?jī)?chǔ)存的器官，它還是一個(gè)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌、能量代謝及炎癥的內(nèi)分泌器官。脂肪組織可以分泌多種激素和細(xì)胞因子，其中脂聯(lián)素是一種重要的脂肪細(xì)胞因

3、子家族成員，其血漿水平在胰島素抵抗和肥胖的情況下降低，在胰島素敏感性增加和體重減輕時(shí)上升。肝臟是葡萄糖代謝的重要器官，具有糖原合成、分解和異生作用。它參與調(diào)節(jié)機(jī)體糖的儲(chǔ)存和分布，維持血糖相對(duì)穩(wěn)定，使各組織能夠不斷得到葡萄糖供應(yīng)。當(dāng)肝臟功能因各種肝病而受損時(shí)，往往影響其正常糖代謝，出現(xiàn)糖耐量減低，部分患者最終發(fā)展成糖尿病。
　　目前認(rèn)為2型糖尿病患者的胰島素水平并不降低，但是肝臟、肌肉及脂肪組織等外周器官存在胰島素抵抗，因此我們將重

4、點(diǎn)研究作為機(jī)體能量代謝中最重要的器官肝臟，并應(yīng)用HepG2細(xì)胞系離體實(shí)驗(yàn)研究其作用機(jī)制，來(lái)解釋RYGB術(shù)后是否能夠緩解肝臟的胰島素抵抗。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器
　　8周齡SPF級(jí)雄性GK大鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。周齡性別匹配的Wistar大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。HepG2細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)國(guó)立細(xì)胞庫(kù)（American Type Culture Collection，ATC

5、C）。
　　10％水合氯醛;RPMI1640培養(yǎng)基;exendin-4;抑肽酶;胰蛋白酶;二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidylpeptidase-4，DPP-4);乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA);大鼠AdipoR2抗體;聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF);大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorb

6、ent assay，ELISA)試劑盒;大鼠adiponectin ELISA試劑盒;等。
　　顯微手術(shù)器械，細(xì)胞培養(yǎng)工作臺(tái)，SANYO MDF-U超低溫冰箱，OLYMPUSAX70倒置顯微鏡，GFL THERMOLAB振蕩水浴箱，PCR擴(kuò)增儀;高速冷凍離心機(jī)，電泳儀，半干轉(zhuǎn)印儀，電子天平，微量泵，PH計(jì)，血糖儀及血糖試紙等。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　（一）實(shí)驗(yàn)分組及處理
　　GK大鼠20只，Wistar大鼠10只

7、分為以下三組:
　　1、RYGB組:GK大鼠10只。賁門處橫斷，遠(yuǎn)斷端結(jié)扎閉鎖。Treitz韌帶遠(yuǎn)端10 cm橫斷空腸，遠(yuǎn)端腸袢經(jīng)結(jié)腸前上提與食管斷端吻合，近端腸袢在食管空腸吻合口遠(yuǎn)側(cè)10 cm處與遠(yuǎn)端腸袢行空腸間側(cè)側(cè)吻合。曠置胃、十二指腸和上段10 cm空腸。
　　2、GK組:GK大鼠10只。在賁門處切斷后再吻合，距Treitz韌帶10 cm處切斷空腸后原位端端吻合，未改變胃腸道正常解剖結(jié)構(gòu)。
　　3、WS組:Wis

8、tar大鼠10只，同GK組行假手術(shù)，作為非糖尿病正常對(duì)照。
　　在第一部分，檢測(cè)手術(shù)前后大鼠體重、攝食率、空腹血糖(fasting blood sugar，F(xiàn)BS)、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）、血漿胰島素、以及胰島素抵抗的變化。測(cè)手術(shù)前后大鼠血漿adiponectin以及肝臟組織AdipoR2受體表達(dá)的變化，肝細(xì)胞內(nèi)AMPK，IRS-2的變化，探討RYGB手術(shù)如何緩解GK

9、大鼠肝臟胰島素抵抗。
　　在第二部分，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)HepG2細(xì)胞AdipoR2在不同濃度脂聯(lián)素作用下的變化，以及siRNA沉默AdipoR2后，HepG2細(xì)胞內(nèi)受體和酶的變化，探討脂聯(lián)素對(duì)肝細(xì)胞糖代謝影響的作用機(jī)理，解答RYGB術(shù)后肝臟緩解胰島素抵抗的機(jī)制。
　?。ǘz測(cè)方法
　　1、電子稱測(cè)量體重及攝食量，計(jì)算攝食率:攝食率=攝食量(g)/體重(Kg)/天。
　　2、血糖儀法檢測(cè)空腹血糖(FBS)和

10、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。
　　3、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法檢測(cè)血漿胰島素和脂聯(lián)素的水平。
　　4、Real-time PCR檢測(cè)肝臟的AdipoR2，AMPK，IRS-2 mRNA的變化，AdipoR2siRNA轉(zhuǎn)染前后HepG2細(xì)胞AdipoR2，AMPK，IRS-2，G6Pase，PEPCK和GLUT2mRNA的變化。
　　（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，用S

11、PSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05差異具有顯著性。
　　結(jié)果：
　　一、RYGB手術(shù)對(duì)緩解GK大鼠肝臟胰島素抵抗的影響
　　結(jié)果顯示RYGB與GK組術(shù)前存在明顯的胰島素抵抗，血糖、OGTT等糖尿病指標(biāo)顯著高于WS組大鼠。但RYGB術(shù)后兩組相比，術(shù)后血糖、OGTT、C-肽、HOMA-IR基本恢復(fù)至正常水平，血漿脂聯(lián)素水平升高。
　　肝細(xì)胞AdipoR2 mRNA水平上RYGB組比WS組上調(diào)2.4

12、7倍，因此說(shuō)明RYGB不僅可以影響血液中脂聯(lián)素的濃度，而且對(duì)肝細(xì)胞的AdipoR2也有上調(diào)的作用。GK組大鼠肝臟組織中AdipoR2 mRNA水平均降低，說(shuō)明長(zhǎng)期高糖作用下不僅降低脂聯(lián)素和胰島素敏感性的同時(shí)，而且下調(diào)AdipoR基因的表達(dá)，使機(jī)體不僅沒(méi)有足量的adiponectin發(fā)揮增加胰島素敏感性的生理效應(yīng)，而且AdipoR表達(dá)減少進(jìn)一步導(dǎo)致了脂聯(lián)素不能有效結(jié)合受體發(fā)揮作用。
　　我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果中表明肝細(xì)胞的AMPKα2 mRN

13、A水平上RYGB組比WS組上調(diào)1.81倍，IRS-2 mRNA水平在RYGB組比WS組上調(diào)3.24倍，說(shuō)明RYGB術(shù)后脂聯(lián)素升高，通過(guò)脂聯(lián)素受體，作用于AMPK信號(hào)通路，增加葡萄糖利用，減少肝糖原異生，并通過(guò)上調(diào)IRS-2，達(dá)到緩解胰島素抵抗的作用。
　　二、脂聯(lián)素改善HepG2細(xì)胞葡萄糖利用的實(shí)驗(yàn)研究
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50μg/ml濃度全長(zhǎng)脂聯(lián)素處理培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞24h后，AMPK，IRS-2和GLUT2在基因水平均

14、有上調(diào)（P＜0.05），而PEPCK，G6Pase基因下調(diào)（P＜0.05），通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明高濃度的全長(zhǎng)脂聯(lián)素對(duì)于肝細(xì)胞的糖代謝有明顯的改善作用，這與我們?cè)隗w動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相一致。實(shí)驗(yàn)中采用siRNA沉默AdipoR2基因后，我們發(fā)現(xiàn)PEPCK，G6Pase基因水平上調(diào)，AMPK和GLUT2下調(diào)，由此我們得出結(jié)論，減少AdipoR2受體數(shù)量可以調(diào)節(jié)AMPK，GLUT2，PEPCK，G6Pase的水平，這樣導(dǎo)致肝細(xì)胞的糖異生增加，葡萄糖利用減

15、少，肝細(xì)胞胰島素敏感性降低、最終形成IR。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，RYGB術(shù)后脂聯(lián)素水平升高，其通過(guò)提高肝細(xì)胞AdipoR2表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的AMPK活性，增加GLUT2和IRS-2數(shù)量，降低PEPCK和G6Pase水平，達(dá)到增加肝細(xì)胞的葡萄糖利用，降低基礎(chǔ)狀態(tài)下肝細(xì)胞糖異生，減輕肝細(xì)胞的胰島素抵抗，由此說(shuō)明RYGB術(shù)后脂聯(lián)素在抑制或延緩肝細(xì)胞IR中具有重要的作用。
　　結(jié)論：
　　1、RYGB對(duì)非肥胖糖尿病GK大鼠2型糖尿病具