流行性乙型腦炎病毒SA14-14-2株全基因組序列分析及E蛋白抗原表位鑒定.pdf

1、流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)是由黃病毒科黃病毒屬的乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一種以蚊蟲為媒介傳播的人和動(dòng)物共患的病毒性疾病,對(duì)人類危害巨大,是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一,對(duì)豬可引起繁殖障礙,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失.豬是JEV的中間宿主,帶毒豬是本病的主要傳染源.因此,控制豬的JE不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)而且對(duì)人類健康都具有十分重要的意義.

2、 本研究首先根據(jù)已發(fā)表的JEV SA14-14-2株基因序列設(shè)計(jì)合成了4對(duì)引物,通過RT-PCR從乙腦病毒SA14-14-2株經(jīng)BHK21細(xì)胞傳至第20代的毒株SA14-14-2-B20中擴(kuò)增得到了覆蓋乙腦病毒基因組全長(zhǎng)的4個(gè)eDNA片段,將所得片段克隆至pMD18-T載體上,經(jīng)測(cè)序和拼接后,獲得了JEV基因組全序列(SA14-14-2-B20).序列分析表明,該JEV基因組全長(zhǎng)10 977bp,含有1個(gè)大的開放閱讀框架,編碼1個(gè)由

3、3 432個(gè)氨基酸殘基組成的聚合蛋白,其5'非編碼區(qū)和3'非編碼區(qū)分別由95和583個(gè)堿基組成.將此全序列與SA14源病毒株核苷酸、氨基酸進(jìn)行比較,同源性均在99﹪以上,突變位點(diǎn)分散于各個(gè)區(qū)域,而且發(fā)現(xiàn)SA14-14-2-B20一些位點(diǎn)和SA(A)及野毒株SA14核苷酸、氨基酸序列相同而與疫苗株SA14-14-2不同,推測(cè)這些區(qū)域可能與減毒沒有關(guān)系.發(fā)現(xiàn)SA14-14-2-B20在3'非編碼區(qū)第10 701位插入一個(gè)堿基G.比較了31株

4、JEV全序列的3'非編碼區(qū),結(jié)果提示10701位堿基G插入?yún)^(qū)域可能是JEV易變位點(diǎn).將SA14-14-2-B20序列與GenBank發(fā)表的31株JEV全序列進(jìn)行同源性分析,以進(jìn)一步了解JEV之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系.本研究所獲得的SA14-14-2-B20株全序列測(cè)定,一方面有助于揭示病毒的致病和減毒機(jī)理,另一方面也為減毒活疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制,主要為監(jiān)控可能發(fā)生的回復(fù)突變提供分子基礎(chǔ).此外,病毒基因組全序列cDNA克隆的建立為進(jìn)一步進(jìn)行感染性

5、克隆的研究奠定了基礎(chǔ). E蛋白是JEV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、細(xì)胞趨向性、病毒毒力和誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)中起重要作用.本試驗(yàn)通過PCR擴(kuò)增EFl(1～291aa)、EF2(292～402 aa)和EF3(403～500 aa)3個(gè)片段,PCR產(chǎn)物分別定向克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1中,經(jīng)誘導(dǎo)各融合蛋白均以包涵體的形式表達(dá).兔抗SA14-14-2病毒血清的EIASA和Western blot結(jié)果均表明EF1和E

6、F2片段1-402aa是E蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū).為對(duì)這一免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域進(jìn)行抗原表位鑒定,設(shè)計(jì)一套52個(gè)部分重疊的短肽,這些短肽覆蓋全部1-402aa片段.將每一個(gè)短肽基因序列分別合成一對(duì)寡核苷酸鏈,退火后插入表達(dá)載體pGEX-6p-1,與GST進(jìn)行融合表達(dá),多數(shù)表達(dá)的融合蛋白以可溶解的形式存在.用JEV陽性血清進(jìn)行 Western blot和EIASA掃描,鑒定出11個(gè)抗原表位,分別為E1(1～16 aa)、E10(73～88 aa)、E

7、11(81～96 aa)、E19(145～160 aa)、E33(257～272aa)、E39(305～320 aa)、E45(353～368 aa)、E47(369～384 aa)、E48(377～392 aa)、E49(385～400aa)和:E63(373～388 aa).通過Western blot蛋白免疫印記對(duì)鑒定的抗原表位進(jìn)行精細(xì)分析,最終確定為9個(gè)抗原表位:E1(1～16 aa)、E10-4(77～84 aa)、E11.2

8、(83～94aa)、E19(145～160 aa)、E33(257～272 aa)、E39-2(309～316 aa)、E45-3(359～362 aa)、E48-1(377～384 aa)、E49(385～400aa).應(yīng)用此9個(gè)融合蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,結(jié)果表明9個(gè)融合蛋白均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)短肽的特異性抗體.且通過中和試驗(yàn)鑒定出E10(73～88 aa)、E39(305～320 aa)為線性中和表位.其中表位E10與現(xiàn)有的報(bào)道區(qū)域重