二色補(bǔ)血草鹽腺發(fā)育機(jī)制的初步研究.pdf

1、全世界的土壤鹽漬化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重,鹽漬化土壤正在向耕地蔓延,經(jīng)濟(jì)發(fā)展、糧食和能源安全正面臨著嚴(yán)峻的威脅。我國鹽漬化土壤面積及次生鹽漬化程度都高于世界平均值。傳統(tǒng)工程學(xué)手段改造鹽堿地存在很多弊端,易造成土壤次生鹽漬化,成本巨大不利于可持續(xù)地改造鹽堿地。所以,發(fā)展一種新的鹽生植物用于抗鹽機(jī)理研究,充分挖掘其潛在的抗鹽基因,就顯得尤為重要,對(duì)于提高農(nóng)作物的抗鹽水平和改良鹽堿地意義重大。鹽堿地中廣泛分布的泌鹽鹽生植物具有典型的鹽腺和鹽囊泡,是區(qū)別

2、于其他鹽生植物和所有非鹽生植物唯一可見的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),可以將體內(nèi)過量積累的鹽離子排出體外從而避免了鹽脅迫,這種泌鹽鹽生植物就提供了良好的抗鹽性研究材料。
　　從上世紀(jì)50年代開始,泌鹽鹽生植物的研究大部分集中于鹽腺結(jié)構(gòu)和泌鹽機(jī)理上,但是探討鹽腺真正的抗鹽機(jī)理關(guān)鍵在于鹽腺的發(fā)育機(jī)制,從根本上揭示鹽腺的發(fā)育機(jī)制對(duì)于真正解釋鹽生植物耐鹽機(jī)理、培育耐鹽作物、進(jìn)而改良鹽漬化土地具有重大意義。本研究利用具有典型鹽腺的二色補(bǔ)血草(Limonium

3、bicolor)為實(shí)驗(yàn)材料,從細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)兩個(gè)方面探索鹽腺的發(fā)育機(jī)制,旨在研究鹽腺的分化方式和篩選控制鹽腺發(fā)育的關(guān)鍵基因。
　　培育二色補(bǔ)血草為一種研究抗鹽性的模式鹽生植物,面臨著一系列瓶頸問題:高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立;飽和突變體庫的獲得;縮短生長周期以及能否自花授粉獲得純合突變體;全面的基因組/轉(zhuǎn)錄組注釋等等。本論文針對(duì)如上問題進(jìn)行了探索,主要結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建了以二色補(bǔ)血草葉片為外植體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)

4、化體系
　　首先設(shè)計(jì)不同種類及濃度的生長調(diào)節(jié)劑配比,以無菌培養(yǎng)1個(gè)月的二色補(bǔ)血草六葉期幼苗的葉片為外植體,篩選最佳再生培養(yǎng)條件,獲得最佳芽再生培養(yǎng)基是MS+1.0mg/L BA+0.2mg/L NAA,再生率達(dá)到96％以上,最適根再生培養(yǎng)基是MS+0.5mg/L IBA。然后探索了根癌農(nóng)桿菌侵染的各個(gè)參數(shù)設(shè)置,采用含有pTCK303質(zhì)粒的EHA105菌株,攜帶有GUS報(bào)告基因以及潮霉素抗性基因等,侵染濃度為0.6-0.7(OD60

5、0),經(jīng)與葉片共培養(yǎng)4天后,置于篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株,芽篩選培養(yǎng)基在芽再生培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加8mg/L潮霉素和600mg/L哌拉西林鈉,根篩選培養(yǎng)基是根再生培養(yǎng)基中添加8mg/L潮霉素。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS染色后呈現(xiàn)陽性,結(jié)合定量PCR檢驗(yàn)和northern雜交的陽性檢驗(yàn)結(jié)果,我們獲得轉(zhuǎn)基因效率為4.43%。高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系為將來的轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證鹽腺發(fā)育及泌鹽基因的功能提供了保障,使二色補(bǔ)血草鹽腺發(fā)育的研究具有了可行性。

6、>　　2.獲得了鹽腺發(fā)育及泌鹽的突變體,確定了二色補(bǔ)血草花的授粉方式
　　利用EMS化學(xué)誘變和60Cogamma輻射誘變兩種方式,探索適合于二色補(bǔ)血草種子的最佳誘變處理方法,由于EMS化學(xué)誘變引起的單堿基對(duì)的改變,并未獲得鹽腺發(fā)育的突變體,但是在gamma射線120Gy的劑量下可以獲得鹽腺發(fā)育的突變體,輻射誘變約30,000粒種子,經(jīng)自發(fā)熒光篩選鑒定后獲得19株鹽腺發(fā)育異常的突變體M0代,經(jīng)葉圓盤分泌檢測后進(jìn)一步鑒定出泌鹽能力顯著

7、增加/減少的突變體。由于自交才有可能最大程度的保存突變體性狀,所以本論文同樣討論了二色補(bǔ)血草花的授粉方式,經(jīng)單株隔離后,觀察花粉管的萌發(fā)情況和收獲種子能力,我們鑒定二色補(bǔ)血草具有自花授粉的能力,單株獲得約200粒種子,為突變純合體的篩選奠定了基礎(chǔ),鹽腺發(fā)育及泌鹽突變體為后期驗(yàn)證鹽腺發(fā)育及泌鹽的關(guān)鍵基因提供了材料準(zhǔn)備,也為以后創(chuàng)建二色補(bǔ)血草鹽腺發(fā)育及泌鹽飽和突變體庫奠定了基礎(chǔ)。
　　3.確定了二色補(bǔ)血草葉片及鹽腺的分化模式
　

8、　利用兩個(gè)典型的發(fā)育時(shí)期,生長一個(gè)月的幼嫩六葉期和三個(gè)月的成熟大葉期葉片,探索二色補(bǔ)血草葉片及鹽腺的分化模式。對(duì)于同一葉片而言,隨著葉面積的不斷伸展,鹽腺密度不斷下降,鹽腺密度與葉面積的增長呈反比。不同葉位的葉片鹽腺的分布規(guī)律:隨著葉位的不斷上升,單個(gè)葉片的鹽腺總數(shù)呈上升的趨勢。二色補(bǔ)血草葉片的鹽腺泌鹽速率和鹽腺分泌總量,均與葉面積的增加呈正比。
　　我們進(jìn)一步觀察分化早期的葉片及子葉上鹽腺的發(fā)育方式,證實(shí)鹽腺的起始細(xì)胞是鹽腺母細(xì)

9、胞經(jīng)輻射對(duì)稱分裂形成可見的四細(xì)胞結(jié)構(gòu),最后形成十六細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。通過子葉和真葉的分化跟蹤發(fā)現(xiàn),鹽腺的分化成熟早于氣孔2天,子葉上的鹽腺四細(xì)胞結(jié)構(gòu)與氣孔的擬分生組織的結(jié)構(gòu)共存,直到鹽腺分化成熟才開始?xì)饪椎姆只?。非損傷微測的結(jié)果顯示,真葉上的鹽腺一旦分化成熟就具有了較強(qiáng)的分泌能力,這樣就為二色補(bǔ)血草的幼苗早期抗鹽性提供了保障。
　　利用微分干涉差顯微鏡和透射電子顯微鏡對(duì)第一片真葉的分化跟蹤,發(fā)現(xiàn)第一片真葉的分化共經(jīng)歷了5個(gè)時(shí)期:未分化時(shí)

10、期、鹽腺分化時(shí)期、氣孔分化時(shí)期、表皮細(xì)胞分化時(shí)期和成熟期,每個(gè)時(shí)期均有特異的時(shí)間段,而且各個(gè)發(fā)育時(shí)期有明確的時(shí)間間隔,與子葉分化模式不同的是,在鹽腺分化成熟后氣孔擬分生組織開始出現(xiàn)并迅速分化為成熟氣孔。對(duì)葉片不同發(fā)育時(shí)期的鹽腺超微結(jié)構(gòu)的觀察顯示,二色補(bǔ)血草鹽腺具有明顯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn):外被加厚的角質(zhì)層;鹽腺細(xì)胞之間以及鹽腺和葉肉細(xì)胞之間大量的胞間連絲;巨大多嵴的線粒體;大量的小囊泡積累(沒有中央大液泡);沒有葉綠體;具有獨(dú)特的自發(fā)熒光現(xiàn)象;而

11、且隨著分化時(shí)間的延長,線粒體更加發(fā)達(dá),胞間連絲和小囊泡劇烈增加,出現(xiàn)大量的囊泡與細(xì)胞膜融合的現(xiàn)象。
　　4.二色補(bǔ)血草葉片發(fā)育轉(zhuǎn)錄組的構(gòu)建
　　基于葉片發(fā)育的不同時(shí)期的劃分,本研究進(jìn)一步進(jìn)行了葉片發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組測序,分別大量富集二色補(bǔ)血草5個(gè)發(fā)育時(shí)期的真葉,提取純化mRNA后,構(gòu)建cDNA文庫,利用Illumina HiSeq2000測序儀進(jìn)行測序,產(chǎn)生雙向各100bp的測序讀長,經(jīng)denovo拼接后與Nr數(shù)據(jù)庫(non-re

12、dundant protein database)進(jìn)行比對(duì)注釋后,利用DEseq方法篩選到各時(shí)期的差異表達(dá)基因共4,696個(gè),K-means聚類后獲得16個(gè)具有不同發(fā)育時(shí)期特異性的cluster,而且DAVID分析顯示各cluster具有不同的功能富集。集中分析鹽腺發(fā)育時(shí)期和未分化時(shí)期的差異表達(dá)基因,共發(fā)現(xiàn)72個(gè)基因可能與鹽腺的發(fā)育有關(guān),隨機(jī)選取26個(gè)拼接的轉(zhuǎn)錄本,通過Real-time PCR證實(shí)與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果相關(guān)性較高,利用鹽腺發(fā)育

13、增加的突變體同樣驗(yàn)證了這些基因參與了鹽腺的分化。針對(duì)未分化時(shí)期的差異表達(dá)基因分析顯示控制鹽腺的分化基因與腺毛具有較高的同源性,而且鹽腺的分化方式同樣暗示了與腺毛具有類似的發(fā)育模式,據(jù)此我們推測,鹽腺與腺毛具有共同的起源。
　　5.利用葉片鹽腺泌鹽轉(zhuǎn)錄組,篩選既參與鹽腺分化又決定泌鹽能力的關(guān)鍵基因
　　利用200mM NaCl處理下具有明顯泌鹽表型的二色補(bǔ)血草成熟葉片,構(gòu)建葉片泌鹽轉(zhuǎn)錄組。經(jīng)拼接后與Nr數(shù)據(jù)庫注釋后,利用Dex

14、us方法獲得處理組和對(duì)照組之間的差異表達(dá)基因5,768個(gè),對(duì)泌鹽轉(zhuǎn)錄組的分析顯示92個(gè)基因可能參與二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽,包括囊泡運(yùn)輸基因、各類離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體、ROS清除系統(tǒng)和ABA等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的基因,以及部分轉(zhuǎn)錄因子,經(jīng)17個(gè)轉(zhuǎn)錄本的體外qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相關(guān)性較好,而且泌鹽能力增加和減少的突變體同樣驗(yàn)證了關(guān)鍵的泌鹽基因。除此之外,經(jīng)與鹽腺不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組比較后,共發(fā)現(xiàn)51個(gè)基因可能既參與鹽腺的發(fā)育過程,又與鹽腺的

15、泌鹽密切相關(guān),這些鹽腺發(fā)育及泌鹽的基因庫為探索鹽腺發(fā)育及泌鹽的分子機(jī)制提供了可靠的背景數(shù)據(jù),為將來確定并驗(yàn)證鹽腺發(fā)育的關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。
　　論文的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):
　　1.構(gòu)建了二色補(bǔ)血草根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化效率為4.43%,為轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證及確證鹽腺發(fā)育的關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。
　　2.發(fā)現(xiàn)二色補(bǔ)血草鹽腺具有獨(dú)特的自發(fā)熒光現(xiàn)象,并利用這種方法首次篩選到大量的鹽腺發(fā)育及泌鹽的突變體,并證實(shí)二色補(bǔ)血草可以實(shí)現(xiàn)

16、自花授粉以保存突變體性狀。
　　3.揭示二色補(bǔ)血草子葉上存在鹽腺,并探討其分化模式,為解釋二色補(bǔ)血草幼苗的早期抗鹽提供了依據(jù)。在個(gè)體水平上解釋鹽腺的分布規(guī)律是,隨葉位的不斷增加,單個(gè)葉片的鹽腺密度及鹽腺總數(shù)都呈增加的趨勢。
　　4.確定二色補(bǔ)血草第一片真葉上鹽腺的分化劃分為5個(gè)明顯的階段:未分化時(shí)期、鹽腺分化時(shí)期、氣孔分化時(shí)期、表皮細(xì)胞分化時(shí)期和成熟期,鹽腺分化階段具有明顯的時(shí)間段,是二色補(bǔ)血草表皮上最早分化成熟的結(jié)構(gòu),比氣