囊泡運輸在二色補血草鹽腺泌鹽中的作用研究.pdf

1、全球土壤鹽漬化現(xiàn)象日趨嚴重，鹽漬化土壤正向耕地蔓延，經(jīng)濟發(fā)展、糧食和能源安全正面臨著嚴峻威脅。鹽堿地廣泛分布的泌鹽鹽生植物具有典型的泌鹽結(jié)構(gòu)鹽腺和鹽囊泡，是區(qū)別于其他鹽生植物和所有非鹽生植物唯一可見的形態(tài)結(jié)構(gòu)。鹽腺是泌鹽鹽生植物最重要的離子排出器官，主要分布在植物的莖、葉表面等地上部分，其功能是把植物體內(nèi)過多的鹽分分泌到體外。因此，鹽腺在調(diào)節(jié)泌鹽鹽生植物體內(nèi)的離子平衡，維持滲透壓穩(wěn)定及提高植物的耐鹽性等方面發(fā)揮重要作用。所以，研究鹽腺泌

2、鹽機制對于揭示泌鹽鹽生植物耐鹽機理和培育耐鹽農(nóng)作物都有非常重要的意義。目前，對鹽腺泌鹽機制的研究大多還停留在解剖學和生理學水平，鹽腺發(fā)育及泌鹽的分子機理的研究相對滯后。如果能夠揭示泌鹽鹽生植物鹽腺泌鹽的分子機理，克隆關鍵基因并最終培育具有泌鹽能力的農(nóng)作物對于開發(fā)和利用鹽堿地生產(chǎn)糧食具有重大意義。
　　二色補血草是一種典型的泌鹽鹽生植物，具有多細胞鹽腺，多分布于鹽堿地和濱海灘涂，在改造鹽堿地和培育耐鹽植物方面具有重要的研究價值，被譽

3、為改造鹽堿地的“先鋒植物”，是研究雙子葉植物鹽腺的理想材料。因此，研究二色補血草鹽腺的泌鹽特征和分子機理具有重要意義。
　　本論文對二色補血草鹽腺超微結(jié)構(gòu)、泌鹽特征和分子機理進行了探究，主要結(jié)果如下：
　　1.研究了二色補血草鹽腺細胞的超微結(jié)構(gòu)特征
　　以二色補血草葉片為材料，使用高壓冷凍、冷凍替代、超薄切片和細胞核DAPI染色技術等，利用透射電子顯微鏡觀察二色補血草鹽腺的超微結(jié)構(gòu)，為研究鹽腺的泌鹽機制奠定了結(jié)構(gòu)基礎。

4、二色補血草鹽腺由16個細胞組成，中央為4個長的分泌細胞，每個分泌細胞外側(cè)均伴有1個長方形的短的毗鄰細胞，再向外依次包圍著4個內(nèi)杯狀細胞和4個外杯狀細胞，鄰近的細胞稱為收集細胞；細胞核較大，富含線粒體、高爾基體和小囊泡，但缺少中央大液泡，也沒有葉綠體；細胞之間通過胞間連絲進行物質(zhì)運輸與信息傳遞，可以把吸收到植物體內(nèi)過多的鹽分運輸?shù)椒置诩毎?，然后排出體外，最大程度的避免了鹽分對植物體產(chǎn)生的傷害；鹽腺被角質(zhì)層包圍，角質(zhì)層中存在分泌孔，植物體吸

5、收的多余的鹽分進入鹽腺后運輸?shù)椒置诩毎徒琴|(zhì)層之間形成的大的收集室內(nèi)，最后通過收集室上方的角質(zhì)層上的分泌孔排出體外；可觀察到鹽腺分泌細胞中小囊泡與細胞質(zhì)膜的融合，說明鹽腺細胞中有類似于胞飲的相反過程的現(xiàn)象發(fā)生；也可看到分泌細胞中多個小囊泡間的相互融合，多個小囊泡可以融合為大的囊泡，表明鹽腺細胞中的小囊泡可能參與鹽腺的離子分泌過程。
　　2.創(chuàng)建了葉圓盤分泌模型用于測定二色補血草葉片單個鹽腺的泌鹽速率
　　利用打孔器將二色補血

6、草葉片打孔成10 mm直徑的葉圓盤，將葉圓盤下表皮向上，浸泡在含有不同濃度NaCl溶液的培養(yǎng)皿中，并在葉圓盤上滴加一層礦物油，這樣既可以避免蒸騰作用帶來的干擾，又可以將葉圓盤鹽腺分泌出來的流體束縛于礦物油中，然后用微量移液器把鹽腺分泌的流體吸出，這樣可以特異地測定鹽腺分泌的流體體積、離子分泌速率以及分泌物的離子組成等參數(shù)。二色補血草葉圓盤分泌模型不僅可用來研究不同濃度 NaCl處理下鹽腺的離子分泌特征，也可作為篩選泌鹽突變體(單個鹽腺的

7、泌鹽速率顯著下降或增加的二色補血草突變體)的一種簡便快捷的方法。
　　3.探究了二色補血草鹽腺的離子分泌途徑和特點
　　掃描電鏡得到的圖片顯示鹽腺的每個分泌細胞在角質(zhì)層中含有一個分泌孔，并且可以看到葉片表面的分泌物位于分泌孔的上方；環(huán)境掃描電子顯微鏡的結(jié)果證實了分泌物的元素構(gòu)成主要是Na和Cl；非損傷微測技術用來直接測定單個鹽腺的單一離子的分泌速率，200 mmol/L NaCl處理顯著提高了鹽腺的Na+和Cl-分泌速率；然

8、而，表皮細胞和氣孔僅分泌極少量的離子。可得出結(jié)論：二色補血草鹽腺細胞含有4個分泌孔，鹽處理下NaCl通過這些分泌孔排出體外。
　　4.發(fā)現(xiàn)了鹽腺細胞內(nèi)K+的積累在二色補血草鹽腺泌鹽過程中起重要作用
　　利用高壓冷凍和冷凍替代技術結(jié)合納米離子探針分析技術在亞細胞水平上研究了二色補血草鹽腺細胞中K和Na元素的原位分布并成像。較高濃度的Na+分布在鹽腺細胞的質(zhì)外體。與對照組(0 mmol/L NaCl)相比，200 mmol/L

9、NaCl處理導致鹽腺細胞的細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)K+和Na+濃度的增加，盡管NaCl處理引起細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)K+/Na+比的小幅下降。然而，NaCl處理卻導致幼苗葉片中K+濃度和K+/Na+比的顯著下降。此外，200 mmol/L NaCl處理下單個鹽腺的Na+分泌速率是對照組的5倍。這些結(jié)果表明，鹽處理下鹽腺細胞中細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)K+的積累可能在二色補血草鹽腺泌鹽過程中起重要作用。
　　5.確定了囊泡運輸參與二色補血草鹽腺的泌鹽過程并

10、克隆了關鍵基因的片段
　　用囊泡化抑制劑 BFA處理二色補血草葉片，首先用葉圓盤法測定鹽腺的泌鹽速率是否受到影響；然后用非損傷微測技術對單個鹽腺分泌的Na+的速率進行直接精確的測量；最后用透射電子顯微鏡觀察鹽腺組成細胞內(nèi)高爾基體的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化。結(jié)果表明，BFA顯著抑制鹽腺泌鹽且鹽腺細胞內(nèi)高爾基體解體，因此，推測囊泡運輸參與二色補血草鹽腺的泌鹽過程。根據(jù)高通量測序篩選得到了5個囊泡轉(zhuǎn)運相關基因并克隆了這些基因的片段，并用RT-P

11、CR技術分析了這5個基因在不同濃度NaCl處理下的表達量，利用分子技術進一步驗證了囊泡運輸在鹽腺泌鹽過程中的作用，為全面闡明鹽腺泌鹽機制打下了基礎。
　　6.篩選了二色補血草鹽腺泌鹽突變體
　　利用離子注入誘變和60Co gamma射線輻射誘變探索適合二色補血草種子的最佳誘變方法，篩選得到了32株鹽腺泌鹽突變體，其中篩選得到了15株單個鹽腺泌鹽增加的突變體和17株單個鹽腺泌鹽減少的突變體，為探討囊泡運輸在二色補血草鹽腺泌鹽中

12、的作用和泌鹽關鍵基因的功能驗證奠定了基礎。
　　本論文主要創(chuàng)新點:
　　1.利用高壓冷凍、冷凍替代和細胞核DAPI染色技術，用透射電鏡觀察二色補血草鹽腺細胞的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)鹽處理后鹽腺細胞形成大量小囊泡且有的與質(zhì)膜融合，表明囊泡化可能參與鹽腺泌鹽過程，為研究囊泡化參與鹽腺的泌鹽機制奠定了結(jié)構(gòu)基礎。
　　2.利用掃描電鏡和環(huán)境掃描電子顯微鏡探究鹽腺的泌鹽途徑和特點，發(fā)現(xiàn)鹽腺細胞含有4個分泌孔，鹽處理下NaCl通過這些分泌

13、孔排出體外。
　　3.利用納米離子探針分析技術，發(fā)現(xiàn)鹽處理下鹽腺組成細胞中細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)K+的積累可能在二色補血草鹽腺泌鹽過程中起重要作用。
　　4.用囊泡化抑制劑BFA處理二色補血草葉片，發(fā)現(xiàn)BFA顯著抑制鹽腺泌鹽且鹽腺細胞內(nèi)高爾基體解體，因此推測囊泡運輸參與二色補血草鹽腺的泌鹽過程?？寺×烁鶕?jù)高通量測序篩選得到的5個囊泡轉(zhuǎn)運相關基因的片段，并用熒光定量PCR技術分析了這5個基因在不同濃度NaCl處理下的表達量，其中三個