大鼠肝臟線粒體極長鏈乙酰輔酶A脫氫酶的表達(dá)、純化及G441突變的鑒定.pdf

1、一、前言：
　　 線粒體脂肪酸β-氧化是心臟和骨骼肌代謝過程中的主要能量來源，尤其是肝臟線粒體β-氧化產(chǎn)生的酮體，在運動、禁食或饑餓狀態(tài)下對機(jī)體供能發(fā)揮重要作用。乙酰輔酶A脫氫酶(Acyl-CoA dehydrogenases，ACADs)是線粒體黃素酶，它有11個亞型，其中短鏈乙酰輔酶A脫氫酶、中鏈乙酰輔酶A脫氫酶、長鏈乙酰輔酶A脫氫酶、極長鏈乙酰輔酶A脫氫酶和乙酰輔酶A脫氫酶9是線粒體β-氧化催化各種長度的直鏈脂肪酸的第一步

2、反應(yīng)的重要的酶。而這五種ACADs的分子量，結(jié)構(gòu)和分布不同，各有特性。極長鏈乙酰輔酶A脫氫酶（Very-long-chain acyl-CoA dehydrogenase，VLCAD）和ACAD-9均為同源二聚體，其分子量約為66.5 kDa，其余的三種ACADs則為同源四聚體結(jié)構(gòu)，分子量為43-45 kDa。VLCAD在線粒體內(nèi)膜結(jié)合，不易提取，需加入清托劑溶膜方能被分離，而其他3種ACADs分布于線粒體基質(zhì)中，無需溶解，易被提取。<

3、br>　　 VLCAD是ACADs家族中的重要一員，它是線粒體β-氧化中催化長鏈脂肪酸第一步反應(yīng)中的關(guān)鍵酶。棕櫚酰輔酶A(C16)和硬脂酰輔酶A(C18)是植物和動物組織中最豐富的脂肪酸化合物，主要由VLCAD進(jìn)行催化。研究表明，VLCAD對C16的活性是LCAD的10倍。VLCAD缺乏會導(dǎo)致脂肪酸β-氧化障礙，C16水平明顯升高，從而對心臟、肌肉、肝臟產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響。與其它β-氧化紊亂比較，VLCAD缺乏癥均有早期發(fā)病、臨床表現(xiàn)形

4、式不一、臨床癥狀嚴(yán)重、死亡率高（75％于發(fā)病2個月內(nèi)死亡）等特點，且大多數(shù)VLCAD缺乏患者均有不同程度心功能和肝功能異常。
　　 目前使用串聯(lián)質(zhì)譜法來檢測疑似病例中血漿?；鈮A的表征，并通過分析研究成纖維細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的脂肪酸氧化和/或VLCAD的基因序列可以確診VLCAD缺乏。盡管在歐美等國VLCAD缺乏已成為新生兒疾病常規(guī)篩查的一部分，但由于癥狀的多樣性及需要在適當(dāng)?shù)臅r間收集血液和尿液標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)的代謝調(diào)查，仍然有大量的V

5、LCAD缺乏癥被漏診。同時，利用目前的手段僅能判斷患者是否存在VLCAD缺乏卻不能評估VLCAD缺乏的程度。
　　 目前尚無確切的治療VLCAD缺乏癥的方法，主要是避免禁食，增加高碳水化合物和中鏈甘油三酯的攝入，減少長鏈脂肪飲食。
　　 盡管有很多學(xué)者對脂肪酸β-氧化和VLCAD缺乏進(jìn)行了大量研究，但其分子機(jī)制仍不明確，從而阻礙了疾病的診斷和合理治療。迄今為止已知的VLCAD缺乏癥的突變位點有80多個，基因表型各不相同。

6、且僅有少數(shù)突變位點得到了研究。甘氨酸-441(Glycine，Gly，G)是在人類、動物、細(xì)菌中均存在的VLCAD蛋白氨基酸。在人類的VLCAD缺乏癥中，G441D突變被稱為致病的突變，其表型為新生兒型和肌肉型。然而對這個突變尚沒有分子和功能的研究。
　　 綜上所述，在本實驗中我們利用原核細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)VLCAD蛋白和其G441突變點，為研究G441突變點對VLCAD蛋白的結(jié)構(gòu)和功能影響奠定基礎(chǔ)，并為VLCAD缺乏的新治療提

7、供理論依據(jù)。
　　 二、實驗方法
　　 1.PCR擴(kuò)增
　　 以大鼠肝臟線粒體cDNA作為野生型（Wild type，WT）VLCAD蛋白的模板，設(shè)計VLCAD引物如下:Forward5'cgc gcg gat cca gga gga att taa aat gag aggatc gca tca cca tca cca tca cgc cag tga ggc cac tca ggc agt tct gga3'，其

8、中含BamHI(GGATCC)酶切位點和CATCACCATCACCATCAC為六個組氨酸標(biāo)簽。Reverse5'ctg cag agt act tta gac tct aag ggg gtt act ggt gac cag3'，其中含ScaI(AGTACT)酶切位點。
　　 2.鑒定PCR產(chǎn)物
　　 3.產(chǎn)物回收
　　 回收陽性PCR產(chǎn)物，回收后的PCR產(chǎn)物和pLM1載體進(jìn)行ScaI和Bam HI雙酶切。

9、　　 4.連接
　　 載體和目的片段將連接成VLCAD::pLM1。使用ScaI酶和Bam HI酶進(jìn)行單酶切和雙酶切來鑒定已連接的VLCAD::pLM1。
　　 5.轉(zhuǎn)化
　　 陽性的VLCAD::pLM1轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞，并克隆篩選。陽性克隆在E.coli strain BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)轉(zhuǎn)化。經(jīng)過蛋白質(zhì)條件表達(dá)并電泳后，可確定最佳的IPTG濃度及溫度為0.5mM IPTG，室溫。
　

10、　 6.純化
　　 大規(guī)模表達(dá)蛋白質(zhì)并純化。使用Hitrap Chelating HP(1ml)柱純化蛋白。首先按照平衡Hitrap柱用5ml水洗，然后均勻打入5ml NiSO4，可看到柱子變成藍(lán)色。水洗去未結(jié)合的Ni2+，然后用5-7ml Start Buffer平衡柱子。將粗蛋白均勻打入柱內(nèi)后，用5ml Washing Buffer洗蛋白，此時不含有六個組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)因為結(jié)合能力不強，即隨著Washing Buffer

11、洗下，收集第二管的樣品用于分析蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。然后用Elution Buffer洗蛋白。純化出來的樣品可用于下面的分析。
　　 7.設(shè)計定點突變G441D引物:Forward5'GATAATGGGGGGCATGGATTTCATGAAGGAACCAG3'Reverse5' CTGGTTCCTTCATGAAATCCATGCCCCCCATTATC3'G441A引物:Forward5'GATAATGGGGGGCATGGCGTTCATG

12、AAGGAACCAG3'Reverse5'CTGGTTCCTTCATGAACGCCATGCCCCCCATTATC3'經(jīng)過PCR反應(yīng)，轉(zhuǎn)化后挑選克隆子，進(jìn)行DNA測序。經(jīng)過測序比對，突變正確的克隆按照上述方法提取質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化表達(dá)蛋白，表達(dá)條件、純化方法、測試方法同WT蛋白。
　　 8.蛋白測試分析
　　 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白的分子量和純度。使用紫外可見（Ultraviolet visible，UV-Vis）光譜

13、掃描儀測試WT蛋白及突變蛋白對C18、C16、C14、 C12、 C8的活性。使用Bradford方法進(jìn)行蛋白定量分析。
　　 三、結(jié)果
　　 1.VLCAD蛋白基因的克隆
　　 通過PCR擴(kuò)增得到了VLCAD蛋白PCR產(chǎn)物，顯示為約1.8KB基因長度。@2.連接反應(yīng)及陽性克隆的篩選
　　 PCR產(chǎn)物與pLM1載體連接成VLCAD::pLM1，并使用ScaI和BamHI進(jìn)行單、雙酶切。單酶切顯示約5.7K

14、B，雙酶切顯示分別約為3.9KB和1.8KB。由電泳結(jié)果可知，連接反應(yīng)與陽性克隆的篩選成功。
　　 3.VLCAD蛋白分析
　　 將收集到的樣品用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)純化的情況。其分子量約為66.5KDa。以上結(jié)果表明，VLCAD蛋白表達(dá)正確，且純度高。
　　 4.分子模擬VLCAD蛋白
　　 4.1.VLCAD蛋白序列的同源比對
　　 使用Clustal W軟件對來源不同的VLCAD蛋白序

15、列進(jìn)行同源比對，根據(jù)比對的結(jié)果可知，G441為高度保守的氨基酸。
　　 4.2.VLCAD蛋白分子模型圖
　　 使用Discovery Studio3.1.軟件對VLCAD蛋白分子模型圖進(jìn)行模擬?？赡M出VLCAD蛋白關(guān)鍵位點氨基酸參加與黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin AdenineDinucleotide，F(xiàn)AD)輔因子的三維結(jié)構(gòu)圖。Glu-462，Trp-249，Thr-217，Ser-223，Arg-366，Gl

16、n-435，Gly-439參加與FAD結(jié)合。而G441是唯一高度保守的獨特序列（Gly-Gly-X-Gly圖案:Gly豐富序列）。
　　 5.突變蛋白質(zhì)檢測
　　 將純化出來的突變蛋白G441D和G441A樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，突變蛋白與WT蛋白比較，分子量均為66.5KDa。
　　 6.VLCAD蛋白光譜及活性分析
　　 已純化出來的突變蛋白與WT蛋白均呈黃色，如圖3-7所示。對他們進(jìn)行紫外

17、分光光度計分析，WT蛋白光譜有三個峰值，分別為274，374和449 nm其比例為4.86∶0.88∶1。WT蛋白和突變蛋白的光譜吸收顯示沒有很大的差異。
　　 7.WT蛋白及突變蛋白定量、活性及酶動力學(xué)測試
　　 7.1.WT蛋白定量為11.11 mg/2L，突變G441D及G441A為10.34 mg/2 L和10.40 mg/2 L，三者之間沒有很明顯的差異。
　　 7.2.突變蛋白和WT蛋白均對C16活性

18、最高。但突變蛋白G441D和G441A對C16的活性分別為11％和25％，明顯低于WT蛋白對C16的活性。
　　 7.3.實驗表明，與WT蛋白相比，G441突變型的反應(yīng)速度顯著降低，其KM是突變酶的3-4倍。
　　 四、討論
　　 ACADs是人體內(nèi)重要的化學(xué)物質(zhì)，它不僅是丙酮酸脫羧，脂肪酸β-氧化的產(chǎn)物，也是脂肪酸合成、膽固醇合成和生酮作用的碳來源。ACADs有11個亞型，VLCAD蛋白是ACADs蛋白家族中一

19、個重要的蛋白。它是線粒體β-氧化中催化長鏈脂肪酸第一步反應(yīng)中的關(guān)鍵酶。
　　 1993年Bertrand首次報道了VLCAD缺乏癥，使人們第一次認(rèn)識到VLCAD缺乏可導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌病變、肝功能異常和肌肉代謝障礙。VLCAD缺乏死亡率極高，尤其在新生兒中，一旦發(fā)病，2個月內(nèi)患兒死亡率甚至高達(dá)75％，其中有相當(dāng)一部分病例在尸檢時才被確診為VLCAD缺乏癥。隨著該病檢測手段和技術(shù)的進(jìn)步，被確診為VLCAD缺乏癥的患者人數(shù)明顯增加。但由

20、于該病起病急，病情進(jìn)展迅速，確診時取樣時間受限制，且大多數(shù)國家尚未普及篩查，因此仍有大量的病例被誤診和漏診。同時，盡管目前有一些關(guān)于VLCAD缺乏癥的研究，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。而目前的診斷方法也不能評估VLCAD缺乏癥的嚴(yán)重程度。因此，研究VLCAD蛋白和其特定突變點的蛋白表達(dá)及功能將為闡明VLCAD缺乏癥的分子機(jī)制和防治研究提供理論依據(jù)。
　　 我們從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)檢索VLCAD同源蛋白數(shù)據(jù)庫序列，

21、使用Clustal W軟件作出多序列比對，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟線粒體VLCAD蛋白與人類肝臟線粒體VLCAD蛋白質(zhì)序列具有85％的相似度。研究表明，分子功能與序列標(biāo)識的相似性相關(guān)。若兩條蛋白基因序列相似性達(dá)80％則被認(rèn)為是同源基因，而大鼠和人類的VLCAD蛋白基因序列相似性高達(dá)85％，提示人類和大鼠VLCAD蛋白具有相似的功能。因此，在本研究中，我們使用原核大腸桿菌系統(tǒng)克隆大鼠肝臟線粒體VLCAD蛋白，用于研究人類WT蛋白和突變蛋白的表達(dá)、純化

22、及突變蛋白的功能變化。
　　 本實驗成功克隆了大鼠肝臟線粒體WT蛋白基因。PCR擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物顯示約為1.8KB基因長度。通過單、雙酶切成功地將陽性PCR產(chǎn)物與pLM1載體連接成VLCAD::pLM1。并經(jīng)DNA測序比對確認(rèn)其為正確的克隆。
　　 將克隆的WTVLCAD蛋白基因進(jìn)行純化，顯示其分子量約為66.5KDa，與以往的報告一致。在既往研究中，常常需要3-4個步驟才能得到純化產(chǎn)物，且每個步驟都有可能會丟失一

23、些產(chǎn)物。因此，若要達(dá)到目標(biāo)產(chǎn)量和理想純度的需求，應(yīng)盡可能的減少純化步驟。我們在實驗過程中，使用了六個組氨酸標(biāo)簽和金屬螯合親和層析介質(zhì)，運用親和層析法純化WT-VLCAD蛋白，使得整個純化過程僅需一步即可完成，大大地縮短了實驗流程，簡化了實驗操作，并提高了產(chǎn)物純度。應(yīng)用同樣的方法我們得到了特定突變點的VLCAD蛋白。
　　 目前已知的VLCAD缺乏癥的突變有80多個位點，基因表型各不相同。且僅有少數(shù)突變位已有相關(guān)研究。其中G441

24、蛋白氨基酸突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的VLCAD缺乏，其表現(xiàn)為心肌病變和肌肉代謝異常。在人類ACADs家族中，與各種來源（動物、細(xì)菌）的VLCAD蛋白進(jìn)行對比，G441具有唯一高度保守的獨特序列（Gly-Gly-X-Gly圖案:Gly豐富序列）。在此序中第二個Gly(G439)蛋白氨基酸是通過氫鍵與FAD的核糖連接，而第一個(G438)和第三個Gly(G441)蛋白氨基酸的功能仍不清楚。相較于G438和G439性質(zhì)穩(wěn)定，不宜突變的特點（尚無G438

25、的突變報告， G439的突變報告也只有一個），G441卻容易突變。且據(jù)報，G441關(guān)鍵氨基酸接近FAD輔因子，且對于維持FAD輔因子的構(gòu)型非常重要。但該蛋白氨基酸的分子和功能研究尚未完成。正因為G441序列的高度保守性，結(jié)構(gòu)和功能的重要性，我們的實驗成功表達(dá)及純化了G441突變蛋白，并模擬了VLCAD蛋白分子三維結(jié)構(gòu)圖。希望通過研究G441蛋白氨基酸的定點突變，來了解該突變點對VLCAD缺乏癥的重要性，以及它與VLCAD蛋白結(jié)構(gòu)和功能的

26、關(guān)系，并為臨床評估VLCAD缺乏嚴(yán)重程度提供一定的理論依據(jù)。
　　 據(jù)報道，G441蛋白氨基酸突變?yōu)樘於彼幔ˋspartic acid, Asp，D）。但考慮結(jié)構(gòu)突變時，所取代的代氨基酸性質(zhì)會影響WT蛋白的理化水平和致病性，代氨基酸與原氨基酸越相似，影響越小。而在眾多的氨基酸中，丙氨酸(Alanine，Ala，A)與Gly結(jié)構(gòu)相似最高，因此我們除了研究G441D突變，也研究了G441突變?yōu)锳la。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，G441D和G

27、441A突變蛋白顯示均約66.5分子量，與野生型相似。蛋白質(zhì)測定顯示W(wǎng)T蛋白和突變蛋白在數(shù)量上無顯著差異。
　　 我們的實驗還發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟線粒體VLCAD成熟蛋白中最常見的氨基酸是Gly和Ala(9.8％)，其次是亮氨酸(9.6％)和絲氨酸(7.3％)。通過多個對比序列分析顯示，Gly保守的頻率為23.33％， Gly的保守殘基占整個保守殘基的35.89％。Gly是最保守的殘基，Asp次之，Gly和Asp結(jié)合占所有保守殘基50

28、％以上，這與Varfolomeev等人研究相一致。這表明在ACADs家族中，特別是在VLCAD蛋白，Gly殘基也發(fā)揮了重要作用。
　　 Gly是一個非常獨特的氨基酸，它以氫作為其側(cè)鏈而不像其他氨基酸以碳作為側(cè)鏈，從而使它成為已發(fā)現(xiàn)蛋白中序列（20個氨基酸）最短的氨基酸序列。由于它沒有任何碳，因此Gly缺乏明顯化學(xué)功能。然而，氫作為殘基的體積非常小，使Gly旋轉(zhuǎn)方便，這意味著Gly的構(gòu)象具有更多靈活性，能適應(yīng)嚴(yán)密的空間，進(jìn)行二級結(jié)

29、構(gòu)的扭轉(zhuǎn)。這種結(jié)構(gòu)的扭轉(zhuǎn)已被認(rèn)為是最常見的非重復(fù)性結(jié)構(gòu)。研究顯示，殘基位點的非重復(fù)結(jié)構(gòu)比重復(fù)結(jié)構(gòu)更有意義，提示結(jié)構(gòu)扭轉(zhuǎn)是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一個重要特點。了解G441突變點，將有助于我們了解β-turns對蛋白結(jié)構(gòu)的影響。我們使用Beta TPred2軟件對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和多比執(zhí)行線進(jìn)行測試，預(yù)測WT蛋白和G441突變蛋白的β-turns。β-turns預(yù)測顯示，G441替換成Asp(G441D)造成了β-turns損失，而在WT和G441A突變蛋白

30、β-turns仍保留。這可能是與Asp和Ala的理化特性相關(guān)。從結(jié)構(gòu)上分析，我們發(fā)現(xiàn)G441位于靠近FAD結(jié)合口袋及數(shù)個催化亞基殘留物相鄰的關(guān)鍵地位，并作為β-turns。
　　 ACADs是一種黃素蛋白質(zhì)，每個同聚體酶包含一個摩爾單位的FAD并呈現(xiàn)為黃色。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)純化的WT蛋白及G441D和G441A突變蛋白仍為黃色。這表明，經(jīng)過一步法純化后FAD輔因子仍緊密的結(jié)合在VLCAD蛋白上，使我們能進(jìn)行下一步的活性測量和

31、分子機(jī)制研究。WT蛋白光譜有三個峰值，分別為274，374和449 nm，其比例為4.86∶0.88∶1。在450 nm的一個顯著吸光度是輔酶含黃素酶的約束特點。我們實驗的VLCAD蛋白光譜吸收特性類似于Izai等人（高峰值分別為277:377:453 nm，比例為3.6∶0.86∶1）和Souri等人（高峰值分別為280:365:450 nm，比例為8∶0.9∶1）的研究。WT蛋白和突變蛋白的光譜吸收無顯著差異。上述結(jié)果表明G441不

32、影響VLCAD蛋白與FAD輔因子結(jié)合，G441蛋白的突變也沒有引起球狀構(gòu)象差異。
　　 然而，G441突變成為G441D和G441A后，對C16這種脂肪酸化合物的酶的活性分別下降11％和25％。實驗還發(fā)現(xiàn)，與WT相比，G441蛋白突變的反應(yīng)速度顯著降低，其KM是突變酶的3-4倍，這說明與WT相比，G441蛋白突變時需要大量的底物才能達(dá)到飽和濃度。
　　 綜上所述，VLCAD缺乏癥是一種臨床表現(xiàn)嚴(yán)重、預(yù)后不良的代謝疾病，而

33、G441突變是VLCAD缺乏的重要原因。深入研究VLCAD蛋白及它突變位點蛋白具有重要意義。本實驗使用原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出來WT VLCAD蛋白和G441突變蛋白，并通過一步親和層析法簡單快捷的純化蛋白，得到了高純度的蛋白產(chǎn)物。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)，造成G441功能下降的可能機(jī)制是G441突變?yōu)镚441D時，扭曲結(jié)構(gòu)的消失，影響了β-turns。而G441突變?yōu)镚441A時，雖然沒有扭曲結(jié)構(gòu)的消失，沒有影響β-turns，但G44

34、1功能同樣出現(xiàn)了下降，需要再下一步的實驗中進(jìn)行深入研究，同時也為將來基因診斷和治療VLCAD缺乏癥提供理論基礎(chǔ)。
　　 四、總結(jié)
　　 1.本實驗使用原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出來WT-VLCAD蛋白和G441突變蛋白，并通過一步親和層析法簡單快捷的純化蛋白，得到了高純度的蛋白產(chǎn)物。
　　 2.G441突變是VLCAD缺乏的重要原因。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)，造成G441功能下降的可能機(jī)制是G441突變影響VLCAD蛋