兔外周血間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及脫細胞軟骨基質(zhì)制備的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 1.探討在皮膚損傷條件下,外周血來源間充質(zhì)干細胞(PBMSCs)的分離培養(yǎng),并觀察其成骨及成軟骨細胞分化的潛能。從而建立一種兔外周血間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法,為將外周血來源的MSCs作為組織工程種子細胞奠定實驗基礎。
　　 2.使用化學消化法脫除同種異體肋軟骨組織內(nèi)細胞成分,形成脫細胞基質(zhì)。同時采用自體外周血MSCs體外誘導向軟骨細胞分化作為種子細胞,與同種異體軟骨脫細胞基質(zhì)共同培養(yǎng),觀察誘導的MSCs在

2、脫細胞基質(zhì)上的生長情況,以期尋找到組織工程化軟骨構建所需的理想種子細胞和生物支架材料。
　　 方法:
　　 1.應用新西蘭大白兔建立皮膚創(chuàng)傷模型,抽取創(chuàng)傷前后兔股靜脈血,用密度梯度離心法分離純化單個核細胞。
　　 2.分別應用α-MEM培養(yǎng)基和LG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,觀察外周血MSCs的生長情況,并用MTT法測定細胞生長曲線,比較不同培養(yǎng)基對外周血MSCs培養(yǎng)效果的影響。。
　　 3.誘導MSCs向

3、成骨細胞分化:取P2代細胞,實驗組用成骨誘導劑誘導MSCs定向分化,對照組用含10％胎牛血清的α-MEM常規(guī)培養(yǎng)液自然分化,觀察細胞形態(tài),并分別進行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色,以檢測堿性磷酸酶及鈣化結節(jié)的形成。
　　 4.誘導MSCs向軟骨細胞分化:取P2代細胞,實驗組用軟骨誘導劑誘導MSCs定向分化,對照組用1096胎牛血清的α-MEM常規(guī)培養(yǎng)液自然分化,觀察細胞形態(tài),免疫組織化學染色法檢測Ⅱ型膠原的表達。
　　 5.

4、另取新西蘭大白兔處死后立即切取肋軟骨,以無菌PBS沖洗后,順序浸入1％Triton X-100和DNAse、RNAse溶液內(nèi)振蕩消化。其中以1％Trixton消化時間長短分為24小時組、48小時組、72小時組和96小時組。分別采用組織切片HE染色、掃描電鏡等方法觀察樣本脫細胞效果并比較。
　　 結果:
　　 1.經(jīng)創(chuàng)傷刺激后所獲得的兔外周血MSCs數(shù)量明顯增加。
　　 2.細胞形態(tài)觀察:原代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞呈圓

5、形、梭形、多角形,傳代純化后呈均一的長梭形。其生長曲線均呈典型的“S”形。通過觀察發(fā)現(xiàn),原代細胞在α-MEM中12h即可貼壁,48h后匯合,5天左右形成分布均勻的細胞集落,7～8天集落逐漸增大,相鄰集落融合成片狀;細胞貼壁及匯合時間要早于LG-DMEM組,且前者形成的集落數(shù)也要高于后者,差異具有統(tǒng)計學意義,說明α-MEM較L-DMEM更有利于外周血間充質(zhì)干細胞的生長。
　　 3.成骨誘導:實驗組細胞可呈多角形、梭形或三角形,有大

6、小不一、長短不均的突起,胞漿內(nèi)可見較大顆粒,胞核呈卵圓形,可見細胞分裂相和2-3個核仁,其增殖速度較緩慢;對照組細胞形態(tài)基本為長梭形,增殖旺盛。實驗組堿性磷酸酶染色顯示PBMSCs胞漿中可見淺棕色至棕黑色的細小顆粒,說明堿性磷酸酶的存在。誘導后的PBMSCs形成的鈣結節(jié)經(jīng)茜素紅染色后,呈明顯陽性(為紅色結節(jié))。對照組為陰性反應。
　　 4.成軟骨誘導:實驗組細胞增殖速度低于對照組,形態(tài)逐漸有長梭形向多角形、圓形轉(zhuǎn)化,隨著誘導時間

7、延長,出現(xiàn)聚集生長的趨勢;對照組細胞基本保持長梭形,增殖能力旺盛。免疫組化結果顯示,實驗組Ⅱ膠原表達逐漸增強,培養(yǎng)兩周后實驗組可見胞漿內(nèi)黃色或棕黃色顆粒出現(xiàn),而對照組陽性細胞不明顯。
　　 5.使用1％Triton X-100溶液與酶聯(lián)合消化法制備兔同種異體肋軟骨脫細胞基質(zhì)至少需要作用96小時,方可完全脫除軟骨部分全部細胞成分。HE染色顯示96小時組肋軟骨樣本細胞成分完全脫失;掃描電鏡顯示脫細胞基質(zhì)軟骨細胞脫除徹底,可見軟骨基質(zhì)