疏肝健脾方對瘤前抑郁型乳腺癌MDSc-NKT細(xì)胞免疫重塑調(diào)控的研究.pdf

1、乳腺癌是威脅婦女健康和生命的常見惡性腫瘤之一，而抑郁焦慮障礙廣泛存在于乳腺癌患者當(dāng)中。研究表明長期的抑郁焦慮狀態(tài)將對乳腺癌患者的免疫功能產(chǎn)生很大的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，在疾病的進(jìn)展中扮演著重要角色。髓系來源的免疫抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一群特異的免疫抑制細(xì)胞，近年來在免疫和腫瘤的研究中逐漸成為熱點(diǎn)。自然殺傷T細(xì)胞(Natural killer T，NKT)，是一群兼具NK細(xì)胞和T

2、細(xì)胞特征的免疫細(xì)胞，包括兩個亞型，能正向或負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，故在腫瘤的免疫調(diào)節(jié)中是一把“雙刃劍”。乳腺癌患者在腫瘤微環(huán)境下，能產(chǎn)生大量的炎性因子，這些炎性因子能募集、擴(kuò)增和激活MDSC，啟動免疫抑制功效，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和逃逸。抑郁障礙會加重炎性因子分泌，加重免疫抑制效應(yīng)。改善乳腺癌患者的抑郁狀態(tài)，重塑NKT細(xì)胞的功能，可以加強(qiáng)拮抗MDSC的免疫效應(yīng)，從而促進(jìn)正常免疫功能的發(fā)揮，最終起到抗腫瘤的效應(yīng)。
　　抑郁焦慮障礙屬于中醫(yī)肝郁范

3、疇，臨床乳腺癌患者常常合并脾虛表現(xiàn)，本研究所用的處方是我科治療肝郁脾虛型乳腺癌的經(jīng)驗(yàn)方。在我們的前期研究工作中，已經(jīng)在持續(xù)抑郁模型（抑郁造模中期接種4T1細(xì)胞）和瘤后抑郁模型（接種4T1細(xì)胞后進(jìn)行抑郁造模）中，對本方在乳腺癌MDSC-NKT細(xì)胞免疫重塑調(diào)控的機(jī)理研究取得了良好的結(jié)果。前期研究顯示，疏肝健脾方（或聯(lián)合吉西他濱化療）對抑郁荷瘤模型進(jìn)行干預(yù)后，能下調(diào)炎性因子如IL-13、IL-6等的表達(dá)，下調(diào)脾臟中MDSC的表達(dá)，上調(diào)T細(xì)胞的

4、亞群的表達(dá)，減少CD8+T細(xì)胞的凋亡。研究證實(shí)，疏肝健脾中藥對乳腺癌MDSC介導(dǎo)的免疫抑制功能有顯著的下調(diào)作用，對控制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移都有良好的作用。本研究主要探索疏肝健脾方在瘤前抑郁荷瘤模型（抑郁造模完成后接種4T1細(xì)胞）中對MDSC-NKT細(xì)胞的免疫調(diào)控功能的影響。
　　1.研究目的
　　通過臨床研究，觀察疏肝健脾方對門診乳腺癌患者抑郁癥狀和中醫(yī)臨床癥狀的改善情況。
　　通過基礎(chǔ)研究，揭示疏肝健脾方對抑郁障礙型乳腺

5、癌髓系抑制性細(xì)胞(MDSC)免疫抑制作用機(jī)制各個環(huán)節(jié)的影響，及對NKT細(xì)胞免疫功能重塑機(jī)制影響。從免疫抑制角度，揭示MDSC與NKT細(xì)胞在抑郁障礙型乳腺癌所誘導(dǎo)的免疫編輯過程的作用。為防治乳腺癌發(fā)生發(fā)展提供新的科學(xué)依據(jù)，同時也為中醫(yī)學(xué)“情志學(xué)說”防治腫瘤增添新的理論基礎(chǔ)，揭示中藥防治腫瘤發(fā)展新的科學(xué)內(nèi)涵。
　　2.研究方法
　　臨床研究:采用SDS(Self-Rating Depression Scale)抑郁測評量表和中醫(yī)

6、證候量表，收錄中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科門診53例乳腺癌患者，通過疏肝健脾方加減治療兩周，對比治療前后量表評分變化。
　　基礎(chǔ)研究:BALB/c雌性小鼠抑郁造模28天后腋下接種4T1炎性乳腺癌細(xì)胞，建立瘤前抑郁障礙型乳腺癌小鼠模型，并完成對模型的評價;分別給予化療藥物吉西他濱、中藥疏肝健脾方以及中西醫(yī)結(jié)合進(jìn)行干預(yù)。模型成功后采集海馬、腫瘤、脾臟和外周血等，檢測MDSC誘導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)各環(huán)節(jié)指標(biāo)。檢測指標(biāo)包括高效液相法檢測海馬

7、中5-HT等神經(jīng)遞質(zhì);流式細(xì)胞技術(shù)檢測MDSC及其亞型、NKT細(xì)胞、T細(xì)胞亞群;磁珠分選及流式技術(shù)檢測小鼠脾臟CD4+T和CD8+T細(xì)胞凋亡;ELISA檢測小鼠外周血中IL-6、IL-4、IL-13、IL-12、IFN-γ、TGF-β和VEGF;硝酸還原法檢測小鼠脾臟NO和iNOS;磁珠分選小鼠脾臟MDSC及RT-PCR檢測脾臟MDSC中JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子。
　　3.研究結(jié)果
　　3.1臨床研究

8、>　　結(jié)果顯示，門診乳腺癌患者伴隨抑郁障礙的占67.92％，輕度抑郁占52.83％，中度抑郁占11.32％，重度抑郁占3.77％。經(jīng)過疏肝健脾方治療后乳腺癌患者伴隨抑郁障礙的占56.6％，輕度抑郁占43.4％，中度抑郁占9.43％，重度抑郁占3.77％。治療前SDS量表標(biāo)準(zhǔn)分小于53分患者，經(jīng)兩周治療后標(biāo)準(zhǔn)分下降9例。治療前標(biāo)準(zhǔn)分大于53分的患者在治療后，標(biāo)準(zhǔn)分下降1-5分為17例，標(biāo)準(zhǔn)分下降6-10分5例，下降大于10分為0例。在接受

9、疏肝解郁中藥治療后，患者中醫(yī)臨床癥狀普遍得到了緩解，中醫(yī)證候量表評分下降也較為明顯，下降主要集中在1-3分和4-6分兩個水平段。
　　3.2基礎(chǔ)研究
　　3.2.1高效液相法檢測抑郁荷瘤模型海馬5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)
　　5-HT、5-HIAA和DA在海馬中的表達(dá)均是中藥組、化療組、中西結(jié)合組明顯高于抑郁荷瘤組，差異顯著(p＜0.05);5-HT的表達(dá)是中藥組高于化療組、中西結(jié)合組(p＜0.05);5-HIAA表達(dá)中藥組表

10、達(dá)高于中西醫(yī)結(jié)合組(p＜0.05); DA的表達(dá)中藥組明顯高于化療組、中西結(jié)合組，具有顯著差異(p＜0.01)。說明抑郁荷瘤能降低5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)，藥物干預(yù)之后5-HT等表達(dá)升高，甚至高于正常組。
　　3.2.2流式細(xì)胞技術(shù)檢測脾臟MDSC及其亞型、NKT細(xì)胞、T細(xì)胞亞群
　　全部荷瘤組MDSC表達(dá)均高于非荷瘤組（空白對照和單純抑郁組），其中抑郁荷瘤組較正常小鼠MDSC含量高出接近1倍;化療組、中西醫(yī)結(jié)合組MDSC表

11、達(dá)小于抑郁荷瘤組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　抑郁荷瘤組NKT細(xì)胞表達(dá)低于中西結(jié)合組、單純抑郁組和空白組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，經(jīng)過中西藥物干預(yù)后NKT細(xì)胞表達(dá)升高。
　　各組CD4+/CD8+比值計算結(jié)果為:空白組的比值高于各組，未經(jīng)干預(yù)的抑郁荷瘤組比值最低;中西醫(yī)結(jié)合組比值大于抑郁荷瘤組(p＜0.05)。
　　說明抑郁和荷瘤狀態(tài)能使MDSC表達(dá)升高，機(jī)體免疫抑制作用增加;經(jīng)過藥物干預(yù)之后能重塑

12、NKT細(xì)胞的功能，有效拮抗了MDSC的免疫抑制效應(yīng)，最終CD4+/CD8+比值上升，證實(shí)疏肝健脾方（或聯(lián)合吉西他濱）能提高機(jī)體的免疫功能。
　　3.2.3磁珠分選小鼠脾臟CD4+T和CD8+T細(xì)胞及凋亡檢測
　　空白組CD8+T細(xì)胞早期凋亡率最低，為1.28％;抑郁荷瘤組早期凋亡率最高，為8.78％;三個治療組中比較結(jié)果為中西醫(yī)結(jié)合組＜化療組＜中藥組。
　　空白組CD4+T細(xì)胞早期凋亡率最低，為2.91％;抑郁荷瘤組早

13、期凋亡率最高，為7.33％;三個治療組中，中西醫(yī)結(jié)合組早期凋亡最少。
　　證實(shí)，中西醫(yī)結(jié)合組能在控制瘤體，改善抑郁狀態(tài)的基礎(chǔ)上，通過降低T細(xì)胞亞群的早期凋亡，從而降低MDSC的免疫抑制效應(yīng)，提高機(jī)體的免疫功能。
　　3.2.4小鼠外周血中MDSC相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)
　　IL-6、IL-4、IL-13、IFN-γ、TGF-β和VEGF在MDSC誘導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)中作為免疫負(fù)向調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，抑郁荷瘤組小鼠表達(dá)最高。經(jīng)藥物干

14、預(yù)后的三個治療組細(xì)胞因子表達(dá)均低于抑郁荷瘤組。
　　IL-12在MDSC誘導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)中正向調(diào)節(jié)免疫功能，抑郁荷瘤組表達(dá)最低，與化療組、中藥組和中西醫(yī)結(jié)合組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。說明經(jīng)過藥物干預(yù)之后，IL-12表達(dá)上調(diào)，能有效的拮抗IL-13的表達(dá)，從而起到限制MDSC激活和擴(kuò)增的作用，對免疫功能起到正向調(diào)節(jié)作用。
　　3.2.5小鼠脾臟NO和iNOS表達(dá)檢測
　　NO和iNOS是MDSC的產(chǎn)物，iNO

15、S可將T細(xì)胞合成所必須的精氨酸代謝為NO和瓜氨酸。體內(nèi)氧自由基和NO結(jié)合的產(chǎn)物ONOO-能使T細(xì)胞內(nèi)蛋白高硝基化，從而使CD+8T細(xì)胞反應(yīng)性下降。
　　化療組、中藥組、抑郁荷瘤組脾臟中NO表達(dá)明顯高于空白組(p＜0.05)，抑郁荷瘤狀態(tài)下小鼠MDSC表達(dá)同樣高于空白組。給藥干預(yù)之后，中藥組、化療組和中西醫(yī)結(jié)合組NO表達(dá)低于抑郁荷瘤組，其中中西醫(yī)結(jié)合組NO含量低于抑郁荷瘤組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。結(jié)果說明在化療和疏肝健脾方

16、治療后，中西結(jié)合組MDSC表達(dá)下調(diào)，免疫抑制作用降低。
　　化療組、中藥組與中西醫(yī)結(jié)合組脾臟iNOS表達(dá)低于抑郁荷瘤組(p＜0.05)。而本研究中iNOS表達(dá)趨勢與MDSC在脾臟中表達(dá)的趨勢相一致，經(jīng)過藥物干預(yù)后能下調(diào)這種免疫抑制的趨勢，但是各個干預(yù)組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　3.2.6磁珠分選小鼠脾臟MDSC及RT-PCR檢測相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子
　　與MDSC擴(kuò)增關(guān)系最密切的通路是JAK-STAT通路。本

17、研究通過磁珠分選技術(shù)，分選出小鼠脾臟MDSC，運(yùn)用RT-PCT技術(shù)對信號通路中的相關(guān)因子進(jìn)行mRNA含量檢測。
　　研究表明抑郁荷瘤組小鼠脾臟MDSC中的JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT6及Arg1、iNOS基因的表達(dá)最高，這與啟動MDSC擴(kuò)增的炎性因子上調(diào)相一致。經(jīng)過藥物干預(yù)之后，尤其是中西醫(yī)結(jié)合干預(yù)之后能顯著地下調(diào)JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相關(guān)基因表達(dá)，單純中藥對各組基因表達(dá)下調(diào)程度不如單純化療和中西

18、醫(yī)結(jié)合，中西醫(yī)結(jié)合干預(yù)之后，MDSC表達(dá)相關(guān)的基因下調(diào)最具有優(yōu)勢。
　　4.結(jié)論
　　臨床研究顯示，中藥疏肝健脾方能改善乳腺癌患者的抑郁狀態(tài)，但是改善主要體現(xiàn)在對輕度抑郁的調(diào)整和軀體癥狀的改善;治療后中醫(yī)肝郁脾虛證的臨床癥狀得到了普遍的緩解。
　　基礎(chǔ)研究顯示，抑郁和荷瘤狀態(tài)能下調(diào)大腦5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)，并且能分泌大量的炎性因子，高表達(dá)JAK-STAT信號通路中相關(guān)基因，包括JAK1、JAK2、STAT1、STA

19、T3、STAT6，從而激活MDSC的擴(kuò)增，啟動免疫抑制功能。核轉(zhuǎn)錄信號因子STAT1、STAT3能增量調(diào)節(jié)下游精氨酸酶Ⅰ（ArgⅠ）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，在iNOS的催化作用下，ArgⅠ能產(chǎn)生大量NO，最終形成大量ONOO-，能破壞CD8+T細(xì)胞免疫激活所必需的pMHC-TCR三元復(fù)合物的完整性和曲度，減少CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生。并且使CD4+T和CD8+T細(xì)胞的早期凋亡增加，從而降低T細(xì)胞正常功能，破壞人體正常的免疫功能