惡性胸腔積液中肺腺癌的耐藥相關基因的表達及臨床意義.pdf

1、目的
　　探討ERCC1、TYMS、RRM1、TUBB3、NonmuscleMyosinⅡ、Myoglobin、MyoD1在惡性胸腔積液的肺腺癌中的表達的分子生物學意義以及確定對以鉑類為基礎的聯(lián)合化療的晚期患者的預后價值。
　　材料與方法
　　1、臨床樣本
　　收集2011到2012年中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診及病房胸腔積液，優(yōu)選以癌細胞為主炎癥細胞較少的，未接受過治療的116例肺腺癌患者惡性胸腔積液作為研究對

2、象，經(jīng)細胞病理診斷及組織水平核實和免疫化學染色診斷為肺腺癌，另20例炎性胸水作為良性對照。6例肺腺癌穿刺樣本。這116例中男47例，，女69例，年齡從26至87歲，平均年齡為57歲，并對50例患者進行了隨訪調查，生存期自確診日至死亡時間或2013年4月末，中位隨訪時間為18個月(15-28個月)，其中48均接受以鉑類為基礎的聯(lián)合化療，2例失訪。
　　2、液基細胞薄層檢測技術（ThinPrepCytologyTest，TCT）

3、>　　收集新鮮胸水25ml左右，室溫下2000r/min離心5分鐘，棄去上清液，加入清洗液再次離心后，棄去上清液，取底層沉淀細胞與保存液混合后，機器Thinprep5000自動制片，并進行染色和鏡下診斷。
　　采用TCT常規(guī)制片，診斷后，每份標本收集新鮮胸水200ml左右，室溫下2000r/min離心5分鐘，經(jīng)95％乙醇固定12小時后石蠟包埋，切片，HE染色后，鏡下觀察，篩選切片。肺穿刺組織標本經(jīng)固定，石蠟包埋并制成切片。

4、　　3、免疫細胞化學染色檢測
　　采用鏈霉素抗生物素-過氧化酶（streptavidin-peroxidase，SP）法，PBS緩沖液代替一抗作為空白對照，DAB顯色，蘇木素復染。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。CK7、TTF-1、vimentin一抗采自美國SantaCruz公司，ERCC1、TYMS、RRM1、TUBB3、NonmuscleMyosinⅡA、Myoglobin、MyoD1一抗采自美國abcam公司。
　　免疫

5、化學染色結果判定:陽性染色為細胞漿或細胞核有棕黃色顆粒，切片中觀察5個高倍鏡視野(200×)，計算5個視野的陽性細胞的平均百分數(shù)，陽性染色細胞＜5％為陰性，≥5％為陽性。
　　4、免疫熒光染色
　　石蠟包埋切片，經(jīng)脫蠟，脫苯和水化后高溫高壓抗原修復，加一抗，4℃過夜，PBS洗三遍，每次5分鐘，加入二抗室溫避光孵育2h。PBS洗四遍，每次五分鐘。加入0.5μg/mlDAPI(PBS配制)染色10分鐘，用PBS洗三遍，去除多余的

6、DAPI?？顾p熒光封片劑封片，顯微鏡觀察，照相。
　　5、Western-Blotting檢測
　　對惡性胸腔積液進行收集，放到-70℃冰箱凍存，良性胸水用于做陰性對照?？偟鞍讖氖占男厮毎刑崛?，用Brodford法測定蛋白濃度，蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，轉印至PVDF膜，5％脫脂奶粉封閉液封閉2h，一抗(1∶500)4℃過夜，后用TTBS洗膜，二抗室溫孵育2小時，TTBS洗膜，Thermo試劑盒發(fā)光。以β-a

7、ctin為內參，用凝膠成像及分析系統(tǒng)(BiolmagingSystems，美國)分析蛋白各條帶的灰度值。所用抗體與免疫化學染色所用的抗體自同一公司。
　　6、統(tǒng)計分析
　　統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，基因表達與臨床特征之間的關系采用chi-squaretest或者Fisher'sexacttest。不同基因間蛋白表達水平相關性采用Spearmancorrelationcoefficients.TheKaplan

8、-Meiermethod和Log-ranktest用于分析患者生存期與基因表達的關系。MultivariateCoxregressionanalysis用于分析年齡，性別與生存期的關系。P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　結果
　　在116例惡性胸腔積液中ERCC1的表達率為37％，TYMS的表達率為36.2％，RRM1的表達率為82.7％，TUBB3的表達率為69.8％。50例中NonmuscleMyosinⅡ的表達率為48

9、％，Myoglobin的表達率為40％，MyoD1的表達率為38％。6例肺穿刺樣本MyoD1免疫組織化學染色均為陰性。MyoD1的細胞免疫熒光染色定位核陽性。七種基因之間的表達具有良好的相關性。具有各基因陽性表達的患者其生存期短于陰性表達的患者。
　　結論
　　ERCC1、TYMS、RRM1、TUBB3、NonmuscleMyosinⅡ、Myoglobin、MyoD1的表達能夠影響采用以鉑類為基礎的聯(lián)合化療為治療方案患者的生