激光誘導(dǎo)熒光DNA分析系統(tǒng)的研究.pdf

1、DNA分析技術(shù)是從生物的分子-基因水平揭示生物的特性，它為生命科學(xué)研究提供了最有效、最便捷的技術(shù)和手段。因此，DNA分析儀器的研究十分重要，它是獲取信息的源頭和基礎(chǔ)。本論文開展了激光誘導(dǎo)熒光DNA分析系統(tǒng)的相關(guān)理論和研制工作，先后完成了兩套檢測系統(tǒng)的設(shè)計與構(gòu)建。它們是基于微通道毛細管電泳技術(shù)的現(xiàn)代光學(xué)檢測系統(tǒng)，具有結(jié)構(gòu)簡單、性能良好、成本較低的優(yōu)點，分辨率達到1bp，也就是單堿基分辨。靈敏度高，對標準DNA樣品pGEM-3zf(+)/H

2、ae III Markers的檢測限是2.4x10-11mol/L。滿足測序和短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)分型對分辨率和靈敏度的要求。主要工作包括兩大部分：微通道毛細管電泳部分和激光誘導(dǎo)熒光檢測部分。 電泳部分主要包括：對微通道內(nèi)壁進行改性，以控制電滲流和抑制吸附；制備性能良好的篩分介質(zhì)能夠?qū)悠冯娪痉蛛x；對涂層、灌膠、進樣系統(tǒng)以及熒光染料的選擇進行優(yōu)化，選用非交聯(lián)的線性聚丙烯酰胺(Linea

3、r Polvacrylamide，LPA)作為涂層材料和可替換的篩分介質(zhì)；測量得到的自制涂層管的電滲流淌度為2.5165×10-8mzV-1s-1，對電滲流的控制滿足DNA樣品分離的要求；研究了電場強度與遷移率的關(guān)系，得到電場強度與電泳電流的關(guān)系曲線；對于本篩分系統(tǒng)，提出了一種新的Ogston修正模型，從而能夠簡單、良好地解釋實驗結(jié)果；考察了DNA樣品中不同長度的片段在不同濃度篩分介質(zhì)中，隨電場強度條件變化的信號強度、展寬和分辨率的變化

4、情況，優(yōu)化篩分質(zhì)濃度為4％LPA。 檢測部分設(shè)計為共焦光路，建立了分別以488nmAr+激光器和532nm固體激光器為光源的兩套系統(tǒng)，由激光器激發(fā)電泳到檢測窗口的DNA片段(標記有熒光染料)，發(fā)射的熒光信號由光電倍增管收集檢測，激發(fā)光路和收集光路三維可調(diào)。通過理論分析和實驗優(yōu)化本系統(tǒng)的設(shè)計：優(yōu)化聚焦于微通道中的激發(fā)光斑大小，增大聚焦到毛細管內(nèi)徑中的激發(fā)光斑尺寸，使光斑尺寸由最小的10μm增大到50μm(充滿了整個毛細管內(nèi)徑)，光

5、電倍增管接收到的熒光信號提高了2～3倍，從而提高系統(tǒng)的信噪比和靈敏度；提出在聚焦物鏡處加折射率匹配液的方法，加匹配液后的熒光信號得到了增強，因而提高了熒光收集效率和靈敏度。通過理論和實驗分析陣列毛細管電泳技術(shù)中雜散光的強度與分布，激發(fā)光束直接照射到毛細管的內(nèi)徑中心時，毛細管產(chǎn)生的雜散光強度是無毛細管的情況下的2.7025倍；對不同內(nèi)徑的微通道毛細管進行比較，優(yōu)化內(nèi)徑為50μm；分析了不同間距的陣列毛細管雜散光情況；所得結(jié)果對提高檢測系統(tǒng)