IL-21信號(hào)通路在血吸蟲(chóng)肉芽腫形成和發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)重組免疫毒素mIL-21-LuffinP1,體外驗(yàn)證其生物活性和靶向性。通過(guò)小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型,觀察重組免疫毒素mIL-21-LuffinP1對(duì)肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫形成的抑制作用并研究其可能的作用機(jī)制,進(jìn)一步搜尋和鑒定IL-21/Th17信號(hào)通路在血吸蟲(chóng)肉芽腫形成和發(fā)展中的作用。
　　方法:采用基因工程技術(shù)將重組基因片段mIL-21-LuffinP1克隆入表達(dá)載體Pet32a(+)中,經(jīng)酶切和DNA序列測(cè)定正確后

2、,轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)mIL-21-LuffinP1融合蛋白。通過(guò)MTT和流式細(xì)胞術(shù),體外檢測(cè)重組毒素mIL-21-LuffinP1的細(xì)胞毒性和靶向性。通過(guò)小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型,病理學(xué)分析mIL-21-LuffinP1對(duì)肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫形成的抑制作用,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠肝臟中Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt和炎癥趨化因子CXCL1、CXCL2mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:成功

3、構(gòu)建重組免疫毒素表達(dá)載體Pet32a(+)-mIL-21-LuffinP1,并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。MTT法顯示mIL-21-LuffinP1能夠明顯抑制表面高表達(dá)IL-21R的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的增殖,其抑制效應(yīng)呈濃度依賴性增強(qiáng),流式雙染SP2/0細(xì)胞表面標(biāo)記IL-21R和AnnenixV,顯示mIL-21-LuffinP1可以針對(duì)表面表達(dá)IL-21R細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,即具有靶向性。以小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型,感染第四周開(kāi)始尾靜脈注射mI

4、L-21-LuffinP1或LuffinP1,感染6周后剖殺小鼠,通過(guò)肝臟切片HE染色和肉芽腫面積統(tǒng)計(jì)分析,顯示mIL-21-LuffinP1具有體內(nèi)抑制肉芽腫病變的作用(P<0.05),而注射LuffinP1組小鼠肝臟肉芽腫病變程度與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。與空白對(duì)照組相比,雖然mIL-21-LuffinP1組小鼠肝臟炎癥趨化因子CXCL1、CXCL2mRNA水平無(wú)明顯差異(P>0.05),但炎性細(xì)胞因子IL-17m

5、RNA水平明顯降低(P<0.05)。值得注意地是,mIL-21-LuffinP1組小鼠肝臟中Th17上游轉(zhuǎn)錄因子ROR-γtmRNA水平并沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)期的降低趨勢(shì),相反,其mRNA水平總體呈上升趨勢(shì),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建并表達(dá)純化出重組免疫毒素mIL-21-LuffinP1,并驗(yàn)證其具有細(xì)胞毒性和靶向性;小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組免疫毒素mIL-21-LuffinP1可以明顯抑制感染日本血吸蟲(chóng)小鼠肝臟肉