miR--424及其參與的Cul2-E2F1-miR--424調(diào)控環(huán)路在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、宮頸癌是全球女性常見惡性腫瘤和癌癥相關(guān)死亡原因之一，嚴(yán)重危害婦女健康。宮頸癌也是迄今病因最為明確的腫瘤，高危人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus，HR-HPV）持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的必需因素。但婦女一生中發(fā)生生殖道HPV感染的幾率高達(dá)80％，大部分在HPV感染后2年內(nèi)便自行消退，僅5-10％呈持續(xù)感染狀態(tài)，而發(fā)生宮頸癌的幾率不足1％。另外，大量研究表明采用單純靶向HR-HPV關(guān)鍵致癌蛋白E6/E7表達(dá)的各種方法均不能完全

2、阻遏宮頸癌細(xì)胞的惡性表型，迄今尚無治療性HPV疫苗問世。由此可見，HR-HPV的感染結(jié)局取決于病毒和宿主的兩個(gè)方面，只有從病毒與宿主交互影響入手，方能闡明病毒致癌過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與關(guān)鍵分子，從而為包括宮頸癌在內(nèi)的各種HPV相關(guān)癌癥開啟全新的防治策略。
　　非編碼微小RNA(microRNAs，miRNAs)參與調(diào)控人類近1/3基因的表達(dá)。miRNAs是一類非編碼的單鏈小分子RNA，主要通過與靶mRNA分子的3'端非編碼區(qū)(3'-UT

3、R)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與機(jī)體的生長、發(fā)育、分化、代謝和死亡等幾乎所有重要的生理過程。近年的研究進(jìn)一步證實(shí)，miRNAs具有抑癌基因或癌基因的功能，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，并在病毒感染性疾病中影響病毒的感染、清除和復(fù)制等過程。與基因網(wǎng)絡(luò)和蛋白網(wǎng)絡(luò)相比，miRNAs作為一種新的強(qiáng)有力的工具，在闡明發(fā)病機(jī)制和確定治療靶點(diǎn)的研究中更具獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。因此，將miRNAs作為切入點(diǎn)進(jìn)一步研究很可能為揭示HR-HPV致宮頸癌發(fā)生

4、發(fā)展的分子機(jī)制帶來新的突破。
　　在我們以往檢測(cè)的HPV陰性正常宮頸組織和HPV16陽性宮頸癌組織的高通量miRNA表達(dá)譜芯片中發(fā)現(xiàn)，miR-424在宮頸癌組織的表達(dá)較正常宮頸組織明顯下降。雖然關(guān)于miR-424的研究較少，但其功能比較明確，對(duì)細(xì)胞分化、增殖、周期和血管生成均有調(diào)控作用，而惡性腫瘤的發(fā)生往往表現(xiàn)為這些細(xì)胞功能的失調(diào)控。為了確定miR-424在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用和調(diào)控機(jī)制，本研究首先通過組織驗(yàn)證、臨床病理參數(shù)

5、分析和細(xì)胞功能驗(yàn)證確定miR-424在宮頸癌中的作用;其次通過靶基因確定和針對(duì)靶基因的組織和功能研究明確miR-424發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)制;然后分析并尋找引起miR-424表達(dá)失調(diào)的基因或可能存在的調(diào)控環(huán)路;最后探討miR-424在宮頸癌中的表達(dá)抑制與HPV16癌蛋白間的關(guān)系。本研究旨在揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，并為探尋宮頸癌防治新策略提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　第一部分 miR-424在宮頸癌中的表達(dá)及功能
　　目的:
　

6、　驗(yàn)證miR-424在宮頸癌組織中表達(dá)下降，分析miR-424與宮頸癌臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性及明確miR-424對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的調(diào)控作用。
　　方法:
　　收集宮頸正常上皮組織和宮頸癌組織標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR）法檢測(cè)74例宮頸正常上皮組織和147例宮頸癌組織的miR-424表達(dá)水平，同時(shí)整理完整的臨床病理

7、資料，分析miR-424的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分別在宮頸癌細(xì)胞株SiHa和CaSki中轉(zhuǎn)染miR-424模擬物（mimic）或模擬物陰性對(duì)照，MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖能力、BrdU聯(lián)合7AAD法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)各組細(xì)胞周期分布、Annexin-Ⅴ聯(lián)合PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力和Transwell聯(lián)合matrigel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　1.miR-424在宮頸癌

8、組織中的表達(dá)較宮頸正常組織顯著下調(diào)。
　　2.miR-424表達(dá)水平與宮頸癌預(yù)后不良相關(guān)的臨床病理參數(shù)，如細(xì)胞分化、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深間質(zhì)浸潤和脈管浸潤均呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　3.宮頸癌細(xì)胞株SiHa和CaSki中恢復(fù)miR-424的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力，促使細(xì)胞周期發(fā)生G1/S期阻滯和促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡，同時(shí)細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受到明顯抑制。
　　結(jié)論:
　　1.miR-424表達(dá)在宮頸癌組織中

9、顯著下降，并與宮頸癌不良預(yù)后因素密切相關(guān)。
　　2.miR-424抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S期阻滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，提示miR-424在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用。
　　第二部分 miR-424通過靶向細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1(Chk1)參與宮頸癌進(jìn)展
　　目的:
　　確定miR-424發(fā)揮功能的靶基因，揭示miR-424在宮頸癌中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　

10、首先，分別在宮頸癌SiHa和CaSki細(xì)胞中高表達(dá)miR-424，qRT-PCR檢測(cè)Chk1mRNA的表達(dá)水平，western blot檢測(cè)Chk1及其活性蛋白p-Chk1(Ser345)的蛋白表達(dá)水平。其次，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)聯(lián)合定點(diǎn)突變法確定miR-424對(duì)Chk1的直接靶向作用。然后，利用siRNA特異性干擾宮頸癌細(xì)胞中Chk1的表達(dá)，westernblot檢測(cè)金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)，MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖能力、BrdU

11、聯(lián)合7AAD法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期分布、Annexin-Ⅴ聯(lián)合PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。最后，在已檢測(cè)過miR-424表達(dá)水平的同一批宮頸組織標(biāo)本中采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Chk1和p-Chk1的蛋白表達(dá)水平及與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并分析與miR-424的組織相關(guān)性。利用western blot法在另外收集的20例宮頸正常組織和40例宮頸癌組織中再次驗(yàn)證Chk1和p-Chk

12、1的蛋白表達(dá)水平。在宮頸癌組織中分析Chk1、p-Chk1和MMP9的組織相關(guān)性及與淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系，明確Chk1在宮頸癌進(jìn)展中的作用和調(diào)控分子。
　　結(jié)果:
　　1.miR-424高表達(dá)抑制Chk1和p-Chk1的蛋白表達(dá)水平，但不影響Chk1的mRNA水平。
　　2.miR-424與含Chk13'UTR區(qū)的報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，可下調(diào)熒火蟲酶的活性，但將Chk13'UTR上miR-424的識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變后再與miR

13、-424共轉(zhuǎn)染，熒火蟲酶的活性不受影響。
　　3.干擾宮頸癌細(xì)胞Chk1的表達(dá)可抑制MMP9的蛋白水平，細(xì)胞增殖能力受阻，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，細(xì)胞周期阻滯于G1期，細(xì)胞凋亡水平增加，細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受抑制。
　　4.Chk1和p-Chk1在宮頸癌組織中的表達(dá)水平均較宮頸正常組織明顯增高，且與多項(xiàng)宮頸癌預(yù)后不良相關(guān)的臨床病理參數(shù)呈顯著正相關(guān)，與miR-424水平呈顯著負(fù)相關(guān)。宮頸癌組織中，Chk1、p-Chk1和MMP9的

14、表達(dá)呈顯著正相關(guān)，三者在淋巴結(jié)陽性的宮頸癌組織中的表達(dá)均較淋巴結(jié)陰性的宮頸癌組織明顯增高。
　　結(jié)論:
　　1.miR-424直接靶向Chk1，并抑制p-Chk1的表達(dá)，提示Chk1是介導(dǎo)miR-424調(diào)控宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的主要效應(yīng)分子。
　　2.Chk1可能通過轉(zhuǎn)化為活性蛋白p-Chk1和正向調(diào)控MMP9的表達(dá)來促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　3.Chk1和p-Chk1高表達(dá)與宮頸癌不良預(yù)后因素密切相關(guān)

15、。
　　第三部分 Cul2/E2F1/miR-424調(diào)控環(huán)路引起宮頸癌細(xì)胞miR-424持續(xù)性表達(dá)抑制
　　目的:
　　證明在宮頸癌細(xì)胞中存在Cul2/E2F1/miR-424調(diào)控環(huán)路，及其對(duì)miR-424表達(dá)的調(diào)控，從而揭示宮頸癌細(xì)胞中miR-424持續(xù)性表達(dá)失調(diào)的原因。
　　方法:
　　siRNA干擾宮頸癌SiHa細(xì)胞中E2F1的表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)miR-424的表達(dá)情況?；瘜W(xué)合成miR-424基

16、因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp序列，克隆到PGL3-Basic載體，再將miR-424啟動(dòng)子區(qū)上E2F1的兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)分別進(jìn)行逐一缺失突變和聯(lián)合缺失突變，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-424啟動(dòng)子活性的改變。分別共轉(zhuǎn)染E2F1 siRNA和miR-424啟動(dòng)子區(qū)、不同突變位點(diǎn)的miR-424啟動(dòng)子區(qū)，檢測(cè)miR-424啟動(dòng)子活性情況，明確E2F1對(duì)miR-424啟動(dòng)子區(qū)具體位點(diǎn)的直接調(diào)控作用。采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)法，針對(duì)m

17、iR-424啟動(dòng)子區(qū)E2F1的可能識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，將免疫磁珠法富集抗體復(fù)合物后解聯(lián)釋放并純化的DNA片段進(jìn)行普通RT-PCR驗(yàn)證，再次明確E2F1對(duì)miR-424啟動(dòng)子區(qū)特定位點(diǎn)的結(jié)合。
　　宮頸癌SiHa細(xì)胞高表達(dá)miR-424，qRT-PCR和western blot分別檢測(cè)Cul2mRNA和蛋白的表達(dá)水平，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)聯(lián)合定點(diǎn)突變法確定miR-424對(duì)Cul2的直接靶向作用。SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cul2 siR

18、NA和Cul2表達(dá)質(zhì)粒，qRT-PCR檢測(cè)正反調(diào)控Cul2后miR-424的表達(dá)改變，western blot檢測(cè)E2F1的表達(dá)情況。構(gòu)建HA標(biāo)記的Cul2表達(dá)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T工具細(xì)胞，收集蛋白進(jìn)行免疫共沉淀(Co-IP)，驗(yàn)證Cul2與E2F1的結(jié)合情況。SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染E2F1 siRNA和E2F1表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)，從正反兩方面驗(yàn)證E2F1通過miR-424間接影響Cul2的表達(dá)。SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi

19、R-424 mimic，qRT-PCR和western blot檢測(cè)E2F1mRNA和蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證miR-424通過調(diào)控Cul2間接影響E2F1的表達(dá)。
　　SiHa細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Cul2 siRNA、Cul2表達(dá)質(zhì)粒、E2F1 siRNA和E2F1表達(dá)質(zhì)粒，CCK8法和ki-67免疫熒光法檢測(cè)Cul2和E2F1對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。
　　結(jié)果:
　　1.SiHa細(xì)胞干擾E2F1的表

20、達(dá)可引起miR-424的表達(dá)上調(diào)，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示E2F1結(jié)合miR-424啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)E2F1識(shí)別位點(diǎn)直接抑制miR-424的啟動(dòng)子活性。
　　2.SiHa細(xì)胞高表達(dá)miR-424促使Cul2 mRNA和蛋白表達(dá)均受抑制，熒光素酶報(bào)告基因顯示miR-424能直接靶向Cul23'UTR區(qū)。SiHa細(xì)胞正向或反向調(diào)控Cul2的表達(dá)，可反饋性引起miR-424出現(xiàn)下調(diào)或上調(diào)表達(dá)，而miR-424的上游分子E

21、2F1的表達(dá)水平與Cul2的表達(dá)同向改變。免疫共沉淀結(jié)果顯示Cul2能與E2F1結(jié)合。
　　3.SiHa細(xì)胞正向或反向調(diào)控E2F1的表達(dá)，Cul2蛋白表達(dá)出現(xiàn)同向改變。高表達(dá)miR-424可引起E2F1表達(dá)下降。
　　4.分別正反兩方面調(diào)控Cul2和E2F1的表達(dá)，Cul2和E2F1均能促進(jìn)SiHa細(xì)胞的增殖能力，ki-67增殖標(biāo)記分子表達(dá)增加，加速細(xì)胞周期從G1期過渡到S期。
　　結(jié)論:
　　1.E2F1是mi

22、R-424的直接上游分子，抑制miR-424的表達(dá)。
　　2.在宮頸癌細(xì)胞存在Cul2/E2F1/miR-424反饋環(huán)路，該環(huán)路的調(diào)控結(jié)果導(dǎo)致miR-424出現(xiàn)持續(xù)性表達(dá)抑制。
　　第四部分 miR-424-高危人乳頭瘤病毒16早期癌蛋白E7的關(guān)系探討
　　目的:
　　確定HPV16早期癌蛋白E7對(duì)miR-424的調(diào)控作用和機(jī)制。
　　方法:
　　采用qRT-PCR法檢測(cè)HPV陰性宮頸正常上皮組織、單

23、純HPV16感染的宮頸正常上皮組織、單純HPV16陽性CINⅡ-Ⅲ和單純HPV16陽性宮頸癌中的miR-424和HPV16 E7的表達(dá)，并分析兩者的組織相關(guān)性。SiHa細(xì)胞過表達(dá)miR-424，qRT-PCR檢測(cè)HPV16 E7的mRNA表達(dá)水平。SiHa細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染HPV16 E7表達(dá)質(zhì)粒和HPV16 E7 siRNA，qRT-PCR檢測(cè)調(diào)控HPV16 E7后miR-424的表達(dá)改變。
　　HA標(biāo)記的HPV16E7表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2

24、93T工具細(xì)胞，免疫共沉淀檢測(cè)HA-E7與E2F1的結(jié)合情況。HA標(biāo)記的HPV16E7表達(dá)質(zhì)粒和Cul2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T工具細(xì)胞，免疫共沉淀檢測(cè)HA-E7與Cul2的結(jié)合情況。SiHa細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染HPV16E7表達(dá)質(zhì)粒和HPV16 E7 siRNA，western blot檢測(cè)HPV16 E7對(duì)E2F1和Cul2的表達(dá)調(diào)控。
　　結(jié)果:
　　1.miR-424在HR-HPV陰性宮頸正常組織、單純HPV16感染宮頸正常組

25、織、單純HPV16感染CINⅡ-Ⅲ和單純HPV16感染宮頸癌組織中表達(dá)逐級(jí)下降，而HPV16 E7的表達(dá)隨著病變進(jìn)展逐級(jí)增高，相關(guān)性分析結(jié)果顯示與miR-424的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)。
　　2.SiHa細(xì)胞高表達(dá)miR-424不能引起HPV16 E7的mRNA表達(dá)水平改變，相反，正向和反向調(diào)控HPV16 E7的表達(dá)，miR-424的表達(dá)水平出現(xiàn)相應(yīng)的下降和上升。
　　3.HPV16 E7能與E2F1直接結(jié)合，并同向調(diào)控E2F1的